Den mikroRNA (miRNA) profiler av menneskeskapte-pluripotent stem (iPS) celler, retinal pigment epitel (RPE) stammer fra menneskeskapte-pluripotent stem (iPS-celler) (iPS-RPE), og foster RPE, ble sammenlignet.
Målet med denne rapporten er å beskrive protokollene for å sammenligne mikroRNA (miRNA) profiler av menneskeskapte-pluripotent stem (iPS-celler), retinal pigment epitel (RPE) utledet fra menneskelige iPS-celler (iPS-RPE), og foster RPE. Protokollene omfatter innsamling av RNA for analyse ved microarray, og analyse av mikroarray data for å identifisere miRNAs som er differensielt uttrykt blant tre celletyper. Metodene for kultur iPS-celler og foster RPE er forklart. Protokollen som brukes for differensiering av RPE fra menneskelige iPS er også beskrevet. Den RNA ekstraksjon teknikk vi beskriver ble valgt for å tillate maksimal gjenvinning av svært små RNA for bruk i en miRNA microarray. Til slutt blir cellemessige og nettverksanalyse av microarray data forklart. Disse teknikkene vil lette sammenligning av de miRNA profiler av tre forskjellige celletyper.
Stamceller har kapasitet til å replikere uten grense, og potensialet til å differensiere til alle somatiske celletype. Utvikling av teknikker for å omprogrammere somatiske celler i pluripotent stamceller, har medført stor spenning i forskersamfunnet og blant klinikere, som bruk av personlig vev gjenfødelse er på horisonten en. Indusert-pluripotent stamceller (iPS-celler) viser samme funksjonene i ubegrenset replicative potensial og pluripotency som embryonale stamceller (ES-celler) mens omgå de etiske dilemmaer knyttet til ESCs. I tillegg vil pasient-avledet stamceller ikke stimulerer en immunrespons, i stor grad øke sannsynligheten for vellykket terapeutiske anvendelser 2-3. Under bestemte kultur vilkår, har iPS-celler er vist å differensiere i flere ulike celletyper in vitro, inkludert cardiomyocytes, nerveceller, betaceller i bukspyttkjertelen, leverceller, og retinal pigmentert epitel (RPE) 4-12.
Den RPE er en spesialisert lag av pigmenterte epitel-celler lokalisert på baksiden av retina som utfører flere funksjoner som er avgjørende for visuell helse og funksjon, for eksempel absorpsjon av strølys, fagocytose av fotoreseptoren ytre segmenter, og behandling av retinoider for produksjonen av visuell chromophore. Dysfunksjon av RPE på grunn av skade eller sykdom dypt påvirker fotoreseptoren helse og visuell funksjon som gjenspeiles av de blindende sykdommer som er et resultat av underliggende RPE patologi som aldersrelatert makuladegenerasjon (AMD), Stargardts sykdom, og retinitis pigmentosa (RP) 13. Virkelig effektive behandlinger som kan gjenopprette synet har ikke blitt oppnådd, og utskifting av sykelig RPE med sunn RPE kan være det beste alternativet for å hindre tap av syn 14-15. RPE avledet fra iPS (iPS-RPE) er en mulig kilde til celler for å erstatte den skadede RPE. iPS-RPE uttrykker kjennetegntic RPE proteiner LRAT, CRALBP, PEDF, og RPE65; viser den klassiske svært pigmentert sekskantede RPE morfologi; og utfører RPE funksjoner som fagocytose, retinoid prosessering og sekresjon av 11 – cis-retinal 5,16. Men før IPS-RPE kan benyttes terapeutisk, er IPS-RPE må være grundig karakterisert. Å forstå de faktorer som styrer RPE differensiering er nødvendig for å forbedre utbyttet og renheten av de celler som skal brukes for kliniske formål.
Celledifferensiering er et resultat av svært regulert genekspresjon. Epigenetisk ombygging av genomet og koordinering av transkripsjonsfaktorer er nødvendig for celle skjebne beslutninger som oppstår under differensiering og utvikling 17. Regulering av melding RNA (mRNA) oversettelse av mikroRNA (miRNA) presenterer enda et nivå for regulering som påvirker celle skjebne en. MiRNAs er korte, ~ 22 nt, lengder av nukleotider som enten undertrykke oversettelse avbinding til 3 'UTR av mRNA eller mål-mRNA for nedbrytning. MiRNAs er påvist i nesten alle vev og til dags dato har over 2000 unike menneskelige microRNAs har blitt registrert i miRBase database. Siden mirnas krever bare delvis komplementaritet å binde seg til målet mRNA, kan en enkelt miRNA potensielt binde seg til flere titalls eller hundrevis av mål, og vice versa, dvs. en enkelt mRNA kan bli målrettet av flere forskjellige miRNAs. Dette promiskuøs bindende karakteristisk dramatisk øker nivået av kompleksitet regulering samt vanskelighetsgraden av å bestemme funksjonene til individuelle mirnas og rollen hver spiller i cellulære funksjoner 18-21. Likevel, har studier vist at miRNA foredler genuttrykk under differensiering ved å påvirke DNA metylering status 17. I en studie mer spesifikke for RPE, ble miR-204/211 vist seg å fremme epitelial fenotype av RPE 22. En annen gruppe analyserte miRNA profilav RPE under differensiering fra ES-celler og avslørte distinkt sett av miRNA er uttrykt i løpet av differensiering prosessen 23. Faktisk kan miRNA profiler entydig skille celletyper, inkludert ES-celler, forløper celler og terminalt differensierte celler 24,25. Over 250 mirnas er uttrykt i netthinnen. Basert på disse studiene, hypotese vi at miRNAs spiller en viktig rolle under differensiering av RPE fra iPS.
Målet med denne rapporten er å beskrive protokollene for differensiering av RPE fra IMR90-4 iPS-celler, samling av RNA for analyse av microarray, og analyse av microarray data for å identifisere mirnas som er forskjellig uttrykt mellom tre celletyper, iPS-celler , iPS-RPE og foster RPE. Total RNA ble hentet fra kulturer av hver celletype og hybridisert til en miRNA microarray, som inneholder prober spesifikke for 1205 menneskelige miRNAs og 144 viral miRNAs. Mikromatriser resultater ble sammenligned for å finne ut hvilke mirnas var forskjellig uttrykt mellom de ulike celletyper. miRNAs med 2 ganger eller mer ganger endring i ekspresjon ble valgt ut for videre analyse. En miRNA analyse program ble brukt til å identifisere potensielle mål av forskjellig uttrykt mirnas og å generere mobilnettverk som reguleres av de valgte mirnas.
I konklusjonen, beskriver denne rapporten metodene som brukes til kultur iPS-celler, iPS-RPE og foster RPE. RPE avledet fra iPS er morfologisk og funksjonelt lik foster RPE. Den iPS-RPE uttrykker også karakteristiske RPE gener inkludert RPE65, CRALBP, PEDF, og LRAT 16. For ytterligere å karakterisere disse cellene, ble RNA ekstrahert og brukt til å utføre mikromatriseanalyse for å identifisere differensielt uttrykt miRNA. Analyse av signal intensiteter avslørte at flest forskjellig uttrykt miRNAs ble op…
The authors have nothing to disclose.
Meningene eller påstander som finnes her, er de private visninger av forfatterne og skal ikke tolkes som offisiell eller som gjenspeiler synspunktene til Department of the Army eller Department of Defense.
Denne forskningen ble utført mens forfatterne Whitney A. Greene, Alberto Muñiz, og Ramesh R. Kaini holdt en National Research Council postdoktor Associateship på USAISR.
Microarray-analyser ble utført av Greehey Barnas Cancer Research Institute microarray Kjerne Facility og bioinformatikk avdeling ved UT Health Science Center San Antonio.
Dette arbeidet ble støttet av US Army Klinisk Rehabilitative Medicine Research Program (CRMRP) og Military Operational Medicine Research Program (MOMRP).
mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |