Perfis de expressão de microRNA iPS Human Cells, Retinal Pigment Epithelium Derivado de Ips, e Fetal Retinal Pigment Epithelium
Summary
O microRNA (miRNA) perfis de tronco humanas pluripotentes induzidas por células (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS) (IPS-RPE) e RPE fetal, foram comparados.
Abstract
O objetivo deste relato é descrever os protocolos para comparar o microRNA (miRNA) perfis de humana induzida por células-tronco pluripotentes (iPS), epitélio pigmentar da retina (RPE) derivadas de células iPS humanas (iPS-RPE) e RPE fetal. Os protocolos incluem a recolha de RNA para análise de microarray, e a análise de dados de microarrays para identificar miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células. Os métodos para cultura de células iPS e RPE fetal são explicados. O protocolo utilizado para a diferenciação de RPE de iPS humana também é descrito. A técnica de extracção de RNA descrevemos foi seleccionado para permitir a recuperação máxima de ARN muito pequena para ser utilizado em um microarray miARN. Finalmente, via celular e análise de redes de dados microarray é explicado. Estas técnicas vão facilitar a comparação dos perfis de miRNA de três tipos de células diferentes.
Introduction
As células estaminais têm a capacidade de se replicar sem limite e o potencial para se diferenciar em qualquer tipo de célula somática. O desenvolvimento de técnicas para reprogramar células somáticas em células-tronco pluripotentes suscitou grande entusiasmo na comunidade científica e entre os médicos, como o advento da regeneração do tecido personalizado está no horizonte 1. Induzido por células-tronco pluripotentes (iPS) apresentam as mesmas características do potencial replicativo ilimitado e pluripotência como células-tronco embrionárias (ES), contornando os dilemas éticos associados à CES. Além disso, as células estaminais derivadas de pacientes não irão estimular uma resposta imune, aumentando grandemente a probabilidade de sucesso de 2-3 aplicações terapêuticas. Sob condições específicas de cultura, as células iPS foram mostrados para se diferenciar em vários tipos de células diferentes in vitro, incluindo os cardiomiócitos, neurónios, células beta pancreáticas, hepatócitos, e epitélio pigmentado da retina (RPE) 4-12.
A EP é uma camada de células epiteliais especializadas pigmentadas localizadas na parte posterior da retina, que desempenha várias funções que são essenciais para a saúde visual e função, tais como a absorção de luz dispersa, a fagocitose dos segmentos externos de fotorreceptores, e processamento de retinóides para a produção de cromóforo visual. Disfunção do EPR devido a lesão ou doença afeta profundamente fotorreceptor saúde e função visual como evidenciado pelas doenças que causam cegueira que são o resultado de patologia RPE subjacente, como a degeneração macular relacionada à idade (DMRI), doença de Stargardt, e retinite pigmentosa (RP) 13. Tratamentos realmente eficazes que possam restaurar a visão não foram alcançados, e substituição de RPE doente com RPE saudável pode ser a melhor opção para evitar a perda de visão 14-15. RPE derivado iPS (IPS-RPE) é uma possível fonte de células para substituir o RPE danificadas. iPS-RPE expressa caracteproteínas RPE tic LRAT, CRALBP, PEDF e RPE65; exibe a morfologia RPE hexagonal altamente pigmentada clássica; e executa funções tais como RPE fagocitose, processamento de retinóide, e secreção de 11 – 5,16 retina cis. No entanto, antes iPS-RPE pode ser usada terapeuticamente, o IPS-RPE deve ser completamente caracterizada. Compreender os factores que regulam a diferenciação EPR é necessário para melhorar o rendimento e a pureza das células a serem utilizadas para aplicações clínicas.
Diferenciação de células é o resultado da expressão de genes altamente regulada. Remodelação epigenética do genoma e da coordenação dos fatores de transcrição são necessários para as decisões do destino da célula que ocorrem durante a diferenciação e desenvolvimento 17. Regulamento de mensagem de RNA (mRNA) Tradução por microRNA (miRNA) apresenta ainda um outro nível de regulação que afeta o destino da pilha 1. MiRNAs são curtos, ~ 22 nt, comprimentos de nucleotídeos que seja tradução suprimir porligação à extremidade 3 'UTR do ARNm ou o ARNm alvo para degradação. MiRNAs foram detectados em praticamente todos os tecidos e até o momento mais de 2.000 microRNAs humanos únicos foram registrados no banco de dados miRBase. Desde miRNAs exigem complementaridade parcial de se ligar ao mRNA-alvo, num único miARN pode potencialmente se ligam a dezenas ou centenas de alvos, e vice-versa, isto é, um único mRNA pode ser alvo de várias miRNAs diferentes. Esta característica de ligação promíscua aumenta dramaticamente o nível de complexidade da regulamentação, bem como o nível de dificuldade de determinar as funções dos miRNAs individuais e do papel que cada um desempenha nas funções celulares 18-21. No entanto, estudos têm mostrado que miRNA refina expressão gênica durante a diferenciação por afetar o estado de metilação de DNA 17. Num estudo mais específico para o EPR, miR-204/211 foi mostrado para promover o fenótipo epitelial do RPE 22. Outro grupo analisado o perfil miRNAde RPE durante a diferenciação de células-tronco embrionárias e revelou conjuntos distintos de miRNA são expressos durante o processo de diferenciação 23. De facto, os perfis de miRNA pode distinguir inequivocamente os tipos de células, incluindo células embrionárias, células precursoras, e células terminalmente diferenciadas 24,25. Mais de 250 miRNAs são expressos na retina. Com base nesses estudos, a hipótese de que os miRNAs desempenham um papel importante durante a diferenciação de RPE de iPS.
O objetivo deste relato é descrever os protocolos para a diferenciação de RPE de IMR90-4 células iPS, coleção de RNA para análise por microarray, e da análise de dados de microarrays para identificar os miRNAs que são diferencialmente expressos entre os três tipos de células, as células iPS , iPS-RPE e RPE fetal. O RNA total foi extraído a partir de culturas de cada tipo de célula e hibridado com uma micromatriz miARN, contendo sondas específicas para 1205 miRNAs humanos e 144 miRNAs virais. Os resultados de microarray foram comparard para determinar quais miRNAs foram diferencialmente expressos entre os diferentes tipos de células. miRNAs com 2 vezes ou mais alterações vezes na expressão foram seleccionadas para posterior análise. Um programa de software de análise de miARN foi usada para identificar potenciais alvos dos miRNAs expressos diferencialmente e para gerar redes celulares regulados por miRNAs seleccionados.
Protocol
Representative Results
Discussion
Em conclusão, este relatório descreve os métodos utilizados para a cultura de células iPS, iPS-RPE e RPE fetal. RPE derivado do iPS são morfológica e funcionalmente similares ao RPE fetal. O iPS-RPE também expressa genes RPE característicos incluindo RPE65, CRALBP, PEDF e LRAT 16. Para melhor caracterizar estas células, o RNA foi extraído e utilizado para realizar a análise de microarray para identificar diferencialmente expressos miRNA. A análise das intensidades de sinal revelou que foi detectad…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
As opiniões ou afirmações contidas neste documento são os pontos de vista particulares de seus autores e não devem ser interpretadas como funcionário ou como refletindo os pontos de vista do Ministério do Exército ou do Departamento de Defesa.
Esta pesquisa foi realizada enquanto os autores Whitney A. Greene, Alberto Muniz, e Ramesh R. Kaini realizou uma Pós-Investigação Associateship Conselho Nacional de Pesquisa da USAISR.
Os ensaios foram realizados por Microarray Facility Cancer Research Institute Microarray Núcleo do Greehey Crianças e Bioinformática Departamento da UT Health Science Center San Antonio.
Este trabalho foi apoiado pelo Exército dos EUA Programa de Clínica de Reabilitação Medicina Research (CRMRP) e Militar Programa de Pesquisa em Medicina Operacional (MOMRP).
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- . Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- . Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- . The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
