İnsan iPS Hücreleri MicroRNA İfade Profilleri, iPS Kaynaklanan Retina pigment epiteli ve Fetal Retina pigment epiteli
Summary
MıkroRNA (miRNA) insan kaynaklı-pluripotent kök (iPS) hücreleri (iPS-RPE), ve fetal RPA'nin türetilen insan kaynaklı-pluripotent kök profilleri (iPS) hücreleri, retina pigment epiteli (RPE), karşılaştırıldı.
Abstract
Bu raporun amacı, MicroRNA (miRNA) insan iPS hücrelerinden (IPS-RPE) türetilen insan kaynaklı-pluripotent kök (iPS) hücreleri, retina pigment epiteli (RPE), ve fetal RPE profilleri karşılaştırmak için protokolleri tanımlamaktır. Protokoller mikro-dizisi ile analiz için RNA'nın toplanması ve diferansiyel olarak üç hücre türleri arasında ifade edilmiştir miRNA'lar tanımlamak için mikro-dizi veri analizi bulunmaktadır. IPS hücreleri ve fetal RPE kültürü için yöntemler açıklanmıştır. İnsan iPS ikinci RPE farklılaşması için kullanılan protokol, aynı zamanda açıklanmaktadır. Biz tarif RNA ekstraksiyon tekniği miRNA mikrodizi kullanılmak için çok küçük RNA maksimum iyileşme sağlamak için seçildi. Son olarak, hücresel yol ve mikroarray verilerinin ağ analizi açıklanmıştır. Bu teknikler, üç farklı hücre tiplerinin miRNA profillerinin karşılaştırılmasını kolaylaştıracaktır.
Introduction
Kök hücreler sınırı ve herhangi bir somatik hücre tipi içine ayırt etmek için potansiyeli olmadan çoğaltmak için kapasitesine sahiptir. Kişiselleştirilmiş doku rejenerasyonu gelişiyle ufukta 1 olduğu gibi pluripotent kök hücrelerinin içine somatik hücreleri yeniden programlamak tekniklerinin geliştirilmesi, araştırma topluluğu ve klinisyenler arasında büyük heyecan yol açmıştır. EKH ile ilişkili etik ikilemleri engellemeyi ise İsteyerek-pluripotent kök (iPS) hücreler (ES) hücreler, embriyonik kök olarak sınırsız Replikatif potansiyeli ve pluripotensin aynı özellikleri gösterirler. Buna ek olarak, bir hastada elde edilen kök hücreleri büyük ölçüde başarılı terapötik uygulamalar 2-3 olasılığını artırarak, bir bağışıklık tepkisi uyarmak değildir. Özel kültür koşulları altında, iPS hücreleri kardiyomiyositlerde, nöronlar, pankreatik beta hücreleri, hepatositler ve retinal pigment epitel (RP de dahil olmak üzere, in vitro olarak birkaç farklı hücre tipleri, içine ayırt gösterilmiştirE) 4-12.
RPE üretimi için özel bir tür fotoreseptör dış bölümlerinin parazit ışık, fagositoz emilme görsel sağlık ve fonksiyonu için gerekli olan bir çok işlevi yerine retinanın arka tarafında yer alan pigmentli epitel hücre tabakası ve retinoidlerin işleme Görsel kromofor. Gibi yaşa bağlı makula dejenerasyonu (YBMD), Stargardt hastalığı ve retinitis pigmentosa (RP) gibi altta yatan RPE patoloji sonucu kör hastalıklar kanıtladığı gibi hasar veya hastalık RPE disfonksiyonu derinden fotoreseptör sağlığı ve görme fonksiyonu etkiler 13. Vizyon geri yükleyebilirsiniz gerçekten etkili tedaviler elde edilmemiştir ve sağlıklı RPE hastalıklı RPA'nin yedek görme 14-15 kaybını önlemek için en iyi seçenek olabilir. IPS (iPS-RPE) türetilmiş RPE hasarlı RPE değiştirmek için hücrelerin olası kaynaktır. iPS-RPE özelliklerini gös ifadetlc RPE proteinler LRAT, CRALBP, PEDF ve RPE65; klasik yüksek pigmentli altıgen RPE morfolojisi görüntüler; cis retinal 5,16 – ve bu fagositoz, retinoid işleme ve 11 salgılama ile RPE işlevleri yerine getirmektedir. IPS-RPE tedavi edici olarak kullanılabilir önce, ancak, iPS-RPE iyice karakterize edilmelidir. RPE farklılaşmayı idare eden faktörlerin anlaşılması klinik uygulamalar için kullanılacak hücrelerin verimini ve saflığını geliştirmek için gereklidir.
Hücre farklılaşması oldukça düzenli bir gen ifadesinin bir sonucudur. Transkripsiyon faktörleri genomunun ve koordinasyonu epigenetik yeniden farklılaşması ve gelişimi sırasında meydana gelen 17 hücre hayati kararlar için gereklidir. MicroRNA (miRNA) tarafından mesaj RNA (mRNA) çeviri Yönetmelik hücre kaderini etkileyen 1. yönetmeliğin henüz bir seviye sunuyor. MiRNA'lar kısa, ~ 22 nt, nükleotidlerin uzunlukları bu bastir çeviri yoluylamRNA'nın 3 'UTR bağlanabilen ya da indirgenmesi için mRNA hedef. MiRNA'lar hemen hemen tüm dokularda tespit edilmiştir ve bugüne kadar 2000'den fazla eşsiz insan microRNA miRBase veritabanında kayıtlı edilmiştir. Yani, tek bir mRNA birkaç farklı miRNAs hedeflenebilir; miRNAs hedef mRNA bağlamak için sadece kısmi tamamlayıcılık gerektirir, tek miRNA potansiyel olarak onlarca veya yüzlerce hedefleri ve tersi bağlanabilir. Bu rastgele bağlanma özelliği dramatik düzenleme karmaşıklık düzeyini yanı sıra bireysel miRNA'ların işlevleri belirlenmesinde zorluk seviyesi ve rol hücresel fonksiyonlarda 18-21 her çalış artar. Bununla birlikte, araştırmalar miRNA DNA metilasyon durumunu 17 etkileyerek farklılaşması sırasında gen ekspresyonunu iyileştirir göstermiştir. RPE için daha özel bir çalışmada, miR-204/211 RPE 22 epitel fenotipine yol gösterilmiştir. Başka bir grup miRNA profili analizRPE ES hücrelerinden farklılaşması sırasında ve miRNA farklı setleri ortaya farklılaşma sırasında 23 olarak ifade edilmiştir. Aslında, miRNA profil açıkça ES hücreleri, ön-madde hücreleri, ve terminal olarak farklılaşmış hücreler 24,25 dahil olmak üzere hücre tipleri, ayırt edebilir. 250'den fazla miRNA'ların retinada ifade edilir. Bu çalışmalara dayanarak, biz miRNA'ların iPS gelen RPE farklılaşması sırasında önemli bir rol oynamaktadır varsayımında.
Bu raporun amacı, IMR90-4 iPS gelen RPE farklılaşması için protokolleri tanımlamak için hücreler, mikroarray ile analiz için RNA'nın toplanması ve diferansiyel üç hücre tipleri arasında ifade edilir miRNA'lar, iPS hücrelerini tanımlamak için mikroarray veri analizi iPS-RPE ve fetal RPE. Toplam RNA, her bir hücre tipi kültürlerinden ekstre edilmiş ve 1205 ve 144 insan miRNAs viral miRNAs spesifik problar ihtiva eden bir miRNA mikroarray hibridize edildi. Mikrodizi sonuçları karşılaştırmak edildimiRNAs farklı olarak farklı hücre tipleri arasında ifade edildi belirlemek için d. 2 kat ya da daha fazla ifade kat değişiklik ile miRNAs daha ileri analiz için seçildi. A MiRNA analiz yazılım programı, farklı şekilde eksprese miRNAs olası hedefleri tanımlamak için ve seçilen miRNAs düzenlenir hücre ağları oluşturmak için kullanılmıştır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Sonuç olarak, bu rapor kültür iPS hücreleri için kullanılan yöntemler, iPS-RPE ve fetal RPE açıklar. IPS türetilen RPE morfolojik ve fonksiyonel olarak fetal RPE benzer. IPS-RPE de RPE65, CRALBP, PEDF ve LRAT 16 gibi karakteristik RPE genleri ifade eder. Bundan başka bu hücrelerin karakterize etmek için, RNA ekstre edilmiş ve farklı şekilde eksprese miRNA belirlemek için mikrodizi analizi için kullanılmıştır. Sinyal yoğunluklarının analizi farklı şekilde ifade miRNA'ların büy?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Burada yer alan görüşler ya da iddiaların yazarların özel görünümleri ve resmi gibi ya da Ordu Departmanı ya da Savunma Bakanlığı görüşlerini yansıtan tefsir edilmesi değildir.
Yazarlar Whitney A. Greene, Alberto Muniz'in ve Ramesh R. Kaini USAISR bir Ulusal Araştırma Konseyi Doktora Sonrası Araştırma Associateship tutarken Bu araştırma yapıldı.
Mikroarray deneyler Greehey Çocuk Kanser Araştırma Enstitüsü Mikrodizi Çekirdek Tesis ve UT Sağlık Bilimleri Merkezi San Antonio Biyoinformatik Bölümü tarafından yapılmıştır.
Bu çalışma ABD Ordusu Klinik Rehabilite Tıp Araştırma Programı (CRMRP) ve Askeri Tıp Yöneylem Araştırma Programı (MOMRP) tarafından desteklenmiştir.
Materials
| mTeSR1 media + 5X supplement | Stem Cell Technologies | 5850 | |
| DMEM/F12 | Life Technologies | 11330-032 | |
| 2-Mercaptoethanol | Sigma | M-7154 | |
| Non essential amino acids | Hyclone(Fisher) | SH30853.01 | |
| Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828-028 | |
| Gentamicin | Life Technologies | 15750-060 | |
| MEM media | Life Technologies | 10370-021 | |
| N1 supplement | Sigma | N-6530-5ML | |
| Taurine | Sigma | T-8691-25G | |
| Hydrocortisone | Sigma | H0888-1G | |
| Fetal bovine serum | Hyclone(Fisher) | SH3008803HI | |
| Triiodo-l-thyronine sodium salt | Sigma | T6397 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Fetal RPE media RTEGM kit | Life Technologies | 195406 | |
| Dispase | Life Technologies | 17105-041 | |
| Matrigel | BD Biosciences | 354277 | |
| Phosphate buffered saline | Hyclone(Fisher) | 10010-023 | |
| Trypsin | Hyclone(Fisher) | 25200-072 | |
| Miltenyi Biotec washing buffer | StemGent | 130-092-987 | |
| Miltenyi Biotec rinsing buffer | StemGent | 130-092-222 | |
| Anti-TRA-1-60 microbead kit | StemGent | 130-095-816 | |
| Miltenyi Biotec cell sorter column | StemGent | 130-021-101 | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| QIA shredder | Qiagen | 79654 | |
| RNA 6000 Pico LabChip kit | Agilent | G2938-90046 | |
| Human miRNA microarray v16 | Agilent | G4471A |
References
- Yu, Z., et al. miRNAs regulate stem cell self-renewal and differentiation. Front Genet. 3, 191 (2012).
- Romano, G., et al. A commentary on iPS cell biology: Potential applications in autologous tissue and cell transplantation, development of new models for the study of human pathological conditions and drug screening. J Cell Physiol. 229, 148-152 (2014).
- Almeida, P. E., et al. Immunogenicity of pluripotent stem cells and their derivatives. Circ Res. 112, 549-561 (2013).
- Buchholz, D. E., et al. Derivation of functional retinal pigmented epithelium from induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 27, 2427-2434 (2009).
- Kokkinaki, M., et al. Human induced pluripotent stem-derived retinal pigment epithelium (RPE) cells exhibit ion transport, membrane potential, polarized vascular endothelial growth factor secretion, and gene expression pattern similar to native RPE. Stem Cells. 29, 825-835 (2011).
- Bharti, K., et al. The new paradigm: retinal pigment epithelium cells generated from embryonic or induced pluripotent stem cells. Pigment Cell Melanoma Res. 24, 21-34 (2011).
- Park, I. H., et al. Reprogramming of human somatic cells to pluripotency with defined factors. Nature. 451, 141-146 (2008).
- Pera, M. F. Stem cells. A new year and a new era. Nature. 451, 135-136 (2008).
- Subba Rao, M., et al. Thinking outside the liver: Induced pluripotent stem cells for hepatic applications. World J Gastroenterol. 19, 3385-3396 (2013).
- Yoshida, Y., Yamanaka, S. iPS cells: a source of cardiac regeneration. J Mol Cell Cardiol. 50, 327-332 (2011).
- Lee, K. S., et al. Human sensory neurons derived from induced pluripotent stem cells support varicella-zoster virus infection. PLoS One. 7, (2012).
- Alipio, Z., et al. Reversal of hyperglycemia in diabetic mouse models using induced-pluripotent stem (iPS)-derived pancreatic beta-like cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 107, 13426-13431 (2010).
- la Cour, M., Tezel, T. The retinal pigment epithelium. Adv Organ Biol. 10, 253-272 (2005).
- Carr, A. J., et al. Protective effects of human iPS-derived retinal pigment epithelium cell transplantation in the retinal dystrophic rat. PLoS One. 4, (2009).
- Schwartz, S. D., et al. Embryonic stem cell trials for macular degeneration: a preliminary report. Lancet. 379, 713-720 (2012).
- Muniz, A., et al. Retinoid uptake, processing and secretion in human iPS-RPE support the visual cycle. Invest Ophthalmol Vis Sci. 55, 198-209 (2014).
- Leonardo, T. R., et al. The functions of microRNAs in pluripotency and reprogramming. Nat Cell Biol. 14, 1114-1121 (2012).
- Arora, A., et al. Prediction of microRNAs affecting mRNA expression during retinal development. BMC Dev Biol. 10, (2010).
- Huntzinger, E., Izaurralde, E. Gene silencing by microRNAs: contributions of translational repression and mRNA decay. Nat Rev Genet. 12, 99-110 (2011).
- Mallanna, S. K., Rizzino, A. Emerging roles of microRNAs in the control of embryonic stem cells and the generation of induced pluripotent stem cells. Dev Biol. 344, 16-25 (2010).
- Guo, H., et al. Mammalian microRNAs predominantly act to decrease target mRNA levels. Nature. 466, 835-840 (2010).
- Adijanto, J., et al. Microphthalmia-associated transcription factor (MITF) promotes differentiation of human retinal pigment epithelium (RPE) by regulating microRNAs-204/211 expression. J Biol Chem. 287, 20491-20503 (2012).
- Hu, G., et al. Identification of miRNA signatures during the differentiation of hESCs into retinal pigment epithelial cells. PLoS One. 7, (2012).
- Wilson, K. D., et al. MicroRNA profiling of human-induced pluripotent stem cells. Stem Cells Dev. 18, 749-758 (2009).
- Neveu, P., et al. MicroRNA profiling reveals two distinct p53-related human pluripotent stem cell states. Cell Stem Cell. 7, 671-681 (2010).
- Maminishkis, A., et al. Confluent monolayers of cultured human fetal retinal pigment epithelium exhibit morphology and physiology of native tissue. Invest Ophthalmol Vis Sci. 47, 3612-3624 (2006).
- Qiagen, miRNeasy Mini Handbook. Sample and Assay Technologies. , (2013).
- . Microarray System with miRNA Complete Labeling and Hyb Kit. Agilent Technologies. , (2011).
- . Maintenance of hESCs and hiPSCs in mTESR1 and mTESR2. Stem Cell Technologies. , (2010).
- . The Analysis of DNA or RNA using its wavelengths: 230 nm, 260 nm, 280 nm. About Biotechnology. , (2013).
