L'objectif du protocole est d'utiliser des méthodes optimales pour stimuler les voies cytoplasmiques ADN de détection dans les cellules et in vivo. Ce résultat est obtenu en améliorant le temps de génération de l'ADN double brin au cours de la ligature d'extrémités franches. Les cellules et les souris sont ensuite transfectées en utilisant un réactif de transfection lipidique.
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Article de méthode
Stimulation de la cytoplasmiques ADN de détection Pathways
Dans cet article
Résumé
Résumé
Afin de stimuler efficacement une réponse immunitaire innée, l'ADN doit être d'une longueur et une pureté suffisante. Nous présentons une méthode où l'ADN double brin (ADN double brin) qui a les caractéristiques requises pour stimuler l'ADN cytoplasmique voies de détection peuvent être générés à moindre coût et en toute simplicité. Par la concatémérisation de courts oligonucléotides synthétiques (qui n'ont pas de motifs CpG), l'ADN double brin peut être généré pour avoir une longueur suffisante pour activer la voie de l'ADN de détection cytosolique. Ce protocole implique de ligature d'extrémités franches les oligonucléotides en présence de polyéthylène glycol (PEG), qui fournit un environnement efficace pour la liaison de se produire. Les concatémères ADN double brin peuvent être utilisés, après purification par extraction au phénol / chloroforme, pour simuler la réponse immunitaire innée in vitro par des protocoles de transfection standard. Cet ADN peut également être utilisé pour stimuler l'immunité innée in vivo par injection intradermique dans le pavillon de l'oreille d'une souris, par exemple. Parstandardisation du processus de concatémérisation et les protocoles de stimulation ultérieures, une activation fiable et reproductible du système immunitaire inné peut être produit.
Introduction
ADN est un élément essentiel de tous les organismes et les cellules eucaryotes, qui maintiennent dans des compartiments spécifiques. Une fonction du système immunitaire inné est de déterminer quand tel cloisonnement tombe en panne ou lorsque le matériau étranger est introduit dans l'organisme par une violation des obstacles externes, physiques. Dans le corps humain, il existe un certain nombre de protéines qui existent à l'aide de petites quantités de dégradation de l'ADN qui peut échapper à la bonne cloisonnement; DNAse I, II, et III défoncer ADN dans le plasma, endosome, et le cytosol, respectivement. Cependant, il a été démontré que des souris....
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Protocole
1. concatémérisation
- Resuspendre les amorces Fw et Rv (voir le tableau des matériaux pour les séquences d'amorces) à une concentration de 10 pg / pl de la biologie moléculaire note H 2 O. Ensuite, mélanger 5 pi de Fw et 5 pi de Rv amorce dans un tube de 1,5 ml.
- Mélange d'amorces de recuit par chauffage à la température d'hybridation appropriée (75 ° C pour les amorces décrites ici) pendant 15 min. Laisser sur le banc de refroidir à la température ambiante (RT). Préparer le PEG8000 60% au cours de cette incubation par dissolution dans le trou DDH 2 O.
- Ajouter 50 ul de 60% PEG8000 (pour atteindre une co....
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Résultats
Les résultats ci-dessous indiquent que l'ADN concatemerized peut être générée avec une relative facilité et est capable de stimuler une réponse immunitaire innée robuste dans des cellules et chez des souris. Avec l'utilisation de PEG8000, il peut être clairement vu que la longueur de l'ADN en cours de création est nettement plus longue et également capable d'induire la transcription de CXCL10. Comme on le voit par analyse sur gel d'agarose, la norme a concatémérisation longueurs d'ADN de pl.......
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Discussion
Les protocoles décrits ici sont utilisés pour générer l'ADN double brin à stimuler la réponse immunitaire innée cytosolique avec des résultats reproductibles dans une large gamme de types de cellules et in vivo. Etant donné que le réactif principal de substrat utilisé est un oligonucléotide synthétique, une certaine souplesse dans ce système pour l'utilisation de séquences d'ADN ou d'autres modifications chimiques. Il est possible, par exemple, à la place de l'oligonucléotide brin avant décr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Les auteurs n'ont aucun remerciements.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Forward amorce | Integrated DNA Technologies | n/a | TACAGATCTACTAGTGATCTATGA CTGATCTGTACATGATCTACA |
| Amorce inversée | Integrated DNA Technologies | n/a | TGTAGATCATGTACAGATCAGT CATAGATCTAGTAGTAGATCTGTA |
| PEG8000 | Sigma-Aldrich | P-4463 | |
| Eau de qualité biologie moléculaire | Sigma-Aldrich | W4502-1L | |
| T4 polynucléotide kinase | Promega | M4101 | |
| T4 ADN ligase | Promega | M1801 | |
| Phénol :chloroforme | Fisher Chemical | BPE1752p-400 | |
| Chloroforme | Fisher Chemical | C/4960/PB08 | |
| Éthanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | |
| Tampon de chargement de gel d’ADN | New England Biolabs | B7021S | |
| Agarose | Bioline BIO-41025 | ||
| Optimem | Life Technologies | 11058021 | |
| TransIT-LT1 ; | Mirus Bioscience | MIR 2300 | |
| Hamilton seringue | Hamilton | 80901 Modèle 1705 | |
| 30 G aiguilles ; | BD Bioscience | 304000 | |
| SYBR Coloration sûre au gel d’ADN | Life Technologies | S33102 | |
| Rneasy Plus Mini Kit | Qiagen | 74134 | |
| Oligo(dT) primer | Thermo Scientific | SO131 | |
| dNTP | mix Fermentas | R0192 | |
| Super Script III transcriptase inverse | Life Technologies | 56575 | |
| Tampon de synthèse de l’ADNc premier brin | Life Technologies | y02321 | |
| SybrGreen qPCR Mélange maître rapide | Applied Biosystems | 4385612 | |
| cxcl10 amorce directe murine ; | Integrated DNA Technologies | n/a | ACTGCATCCATATCGATGAC |
| cxcl10 amorce inverse murine | Integrated DNA Technologies | n/a | TTCATCGTGGCAATGATCTC |
| il6 amorce directe murine ; | Integrated DNA Technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAAGAC |
| il6 murine forward primer ; | Integrated DNA Technologies | n/a | GTAGCTATGGTACTCCAGAC |
Références
- Yoshida, H., Okabe, Y., Kawane, K., Fukuyama, H., Nagata, S. Lethal anemia caused by interferon-beta produced in mouse embryos carrying undigested DNA. Nat. Immunol. 6, 49-56 (2005).
- Ishikawa, H., Ma, Z., Barber, G. N. STING regulates intracellu....
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Réimpressions et autorisations
