소설 보컬 폴드 생물 반응기의 구조 및 특성
Summary
A novel vocal fold bioreactor capable of delivering physiologically relevant, vibratory stimulation to cultured cells is constructed and characterized. This dynamic culture device, when combined with a fibrous poly(ε-caprolactone) scaffold, creates a vocal fold-mimetic environment that modulates the behaviors of mesenchymal stem cells.
Abstract
In vitro engineering of mechanically active tissues requires the presentation of physiologically relevant mechanical conditions to cultured cells. To emulate the dynamic environment of vocal folds, a novel vocal fold bioreactor capable of producing vibratory stimulations at fundamental phonation frequencies is constructed and characterized. The device is composed of a function generator, a power amplifier, a speaker selector and parallel vibration chambers. Individual vibration chambers are created by sandwiching a custom-made silicone membrane between a pair of acrylic blocks. The silicone membrane not only serves as the bottom of the chamber but also provides a mechanism for securing the cell-laden scaffold. Vibration signals, generated by a speaker mounted underneath the bottom acrylic block, are transmitted to the membrane aerodynamically by the oscillating air. Eight identical vibration modules, fixed on two stationary metal bars, are housed in an anti-humidity chamber for long-term operation in a cell culture incubator. The vibration characteristics of the vocal fold bioreactor are analyzed non-destructively using a Laser Doppler Vibrometer (LDV). The utility of the dynamic culture device is demonstrated by culturing cellular constructs in the presence of 200-Hz sinusoidal vibrations with a mid-membrane displacement of 40 µm. Mesenchymal stem cells cultured in the bioreactor respond to the vibratory signals by altering the synthesis and degradation of vocal fold-relevant, extracellular matrix components. The novel bioreactor system presented herein offers an excellent in vitro platform for studying vibration-induced mechanotransduction and for the engineering of functional vocal fold tissues.
Introduction
상피 층으로 구성된 인간의 성대는 고유 층 (LP) 및 vocalis 근육, 사운드 제작을위한 음향 파에 폐에서 공기 흐름을 변환하는 전문 부드러운 조직이다. 1 성대가 정상 발성을하는 동안 정기적으로 진동, 에 이르기까지 기본 주파수에서 최대 30 %의 변종을 나타내는 100 ~ 300 Hz에서에서. 2 성인 성대 LP는 표면 (SLP)로 구성된 그라데이션 구조, 중간 (ILP)과 깊이 (DLP) 층이다. 또한 분류 그룹 상피 세포와 점막 층으로 SLP, 그리고 보컬 인대에 ILP 및 DLP를 결합합니다. 3 인대가 성숙 콜라겐과 엘라스틴 섬유가 풍부하면서 SLP 층, 띄엄 띄엄 분산 된 콜라겐 섬유와 주로 비정질 매트릭스를 포함 충분한 강도를 제공 할 수 있습니다. 4의 구조와 신생아 성대의 역학은 성숙한 대응 크게 다릅니다. 비록 메커니즘성대의 발전과 성숙을 조절의는 아직 완전히 실험적인 증거가 발성 파생 기계적 스트레스의 정의 역할을 지적했다, 이해되지 않습니다.
음성 남용, 감염, 화학적 자극 및 수술 등 여러 가지 건강 상태는 성대가 손상 될 수 있습니다. 성대 장애는 미국 인구의 추정 3-9% 영향을 미친다. 성대 질환에 대한 현재의 치료 방법은 5 개 제한하고 줄기 세포 기반 조직 공학 방법은 성대 기능 복원을위한 유망한 전략으로 떠오르고있다. 중간 엽 줄기 세포 (MSC) 성대 조직 공학에 대한 기본 성대 섬유 아 세포에 대한 적절한 대안입니다. 6-9 줄기 세포의 운명 사양 및 이후의 조직 개발은 기계 상태가되는가에있는 특정 틈새 시장에 의해 매개되는 중요한 요소. 10 기계적 힘은 조직의 형태 형성에 필수적인 레귤레이터이다ND 특히 일상적으로 조직 공학의 관점에서로드. 11을 실시하고 조직에 대한 항상성은, 그것은 노출 생리학 관련 기계적 자극이 세포 분화 및 조직 별 매트릭스 리모델링 줄기 촉진하는 것으로 입증되었다. 12-15
조직 배양 용 바이오 리액터는 시험 관내 세포 또는 조직 성장을위한 바람직한 생리적 환경을 시뮬레이션하기 위해 설계된다. 성대 조직 공학의 경우, phonating 성대의 기계적인 환경을 재현하는 것이 특히 중요합니다. 이상적인 성대 생물 반응기 효과적으로 주파수, 진폭과 진동의 기간 동안 손쉬운 제어를 허용, 배양 세포에 진동 신호를 제공한다. Titze 및 동료 기질 단백질의 세포 생산을 자극하는 높은 주파수 (20 ~ 200 Hz에서) 진동과 정적 스트레칭을 결합한 성대 생물 반응기 (T1 생물 반응기) 16을 고안했습니다. 저기서g이 생물 반응기, 웹의 동료 (17)은 히알루 론산 (HA) 기반의 하이드로 겔에서 배양 피부 섬유 아세포에서 10 일, 100 Hz에서 진동의 영향을 연구했다. 진동이 구문은 HA 합성 효소-2 (HAS2) 정적 컨트롤을 기준으로, decorin, fibromodulin 매트릭스 메탈-1 (MMP1)의 높은 발현을 보였다. 자극 효과가 따라 시간이 될 것으로 밝혀졌다. 더 최근에는, 단체 (18)는 전력 증폭기, 함수 발생기, 봉입 시끄러운 스피커 및 세포 부착에 진동 공기 전송 원주 정박 실리콘 막을 사용 성대 생물 반응기 (J1 생물 반응기)를 조립했다. J1 생물 반응기에서 배양 신생아 포피의 섬유 아 세포는 최대 0.05 %의 평면 변형으로, 60, 110 또는 300 Hz에서 진동이 1 시간을 실시 하였다. qPCR의 결과는 몇 가지 ECM 유전자의 발현이 적당히 다양한 진동 주파수에 대한 응답으로 변경된 것을 제안및 진폭.
이러한 생물 반응기 설계, 음모를 꾸미는 동안, 몇 가지 제한이 있습니다. 예를 들어, T1 시스템이 달성 가능한 최대 주파수를 제한하는 기계적 결합을위한 커넥터와 바의 다수를 필요로한다. 또한, 세포는 데이터 해석을 복잡 바람직 기계적 교반 및 액체 섭동을 거치게된다. J1 생물 반응기는, 반면에, 상대적으로 낮은 에너지 변환 효율을 나타내고 사용자 친화적 아니다. 또, 진동이 빈번 내부 실리콘 막에서 세포 함유 구조물을 분리. J1 버전과 동일한 원칙에 따라 설계 여기에보고 J2 성대 생물 반응기는, 일관성과 재현성에 최적화되어 있습니다. 발성을 흉내 낸 진동은 MSC-채워 섬유 폴리 (ε-카프로 락톤) (PCL) 발판이 effectiv 있습니다 개별적으로 장착되어 진동 챔버에 공기 역학적으로 생성됩니다엘리 확보했다. 레이저 도플러 진동계 (LDV)는 사용자가 멤브레인 / 지지체 조립체의 진동 프로파일을 확인한다. 우리의 데모에서는 중간 엽 줄기 세포 7 일 동안 12 시간의 매일의 총 1 시간 -에 – 1 – 시간 – 오프 (의) 패턴으로 200 Hz의 정현파 진동에 노출되어 있습니다. 부과 된 진동 신호에 대한 세포 반응을 체계적으로 조사하고 있습니다. 전반적으로, J2 성대 동적 세포 배양 연구는 높은 처리량과 재생 가능한 방식으로 수행 할 수 있도록, 가장 사용자 친화적 인 기능을 제공합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
체외에서 기능 성대 조직의 성공적인 설계는 다 능성 세포의 행동을 중재하기 위해 성대와 같은 미세 환경의 휴양이 필요합니다. 그것은 일반적으로 조직 또는 장기 구조 그들이 수행하는 데 필요한 기능을 반영하는 것으로 받아 들여진다. 성대 조직 22는, 발성 중에 발생 고주파 진동은 조직의 성숙을위한 중요한 것으로 제시된다. 성대 생물 반응기 배양 된 중간 엽 줄기 세포에 생…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 공 촛점 이미징에 대한 자신의 훈련과 조언을 닥터 제프리 캐플란 감사합니다. 우리는 또한 SEM의 지원 중사 전자 현미경 연구소 박사 Chaoying 니켈 감사합니다. 이 작품은 건강 (NIDCD, R01DC008965 및 R01DC011377)의 국립 연구소에 의해 자금 지원됩니다. ABZ은 NSF 통합 대학원 교육 및 연구 훈련생 자금 (IGERT) 프로그램을 인정합니다.
Materials
| silicone elastomer kit | Dow Corning | Sylgard 184 | cure the membrane at 100 C for 2 hr |
| PCL | Sigma Aldrich | 440744-500G | Mn ~ 80 kDa, dissolve overnight |
| chloroform | Sigma Aldrich | C7559-5VL | |
| human bone marrow-derived MSCs | Lonza | PT-2501 | received with passage 2 |
| MSC maintenance media | Lonza | PT-3001 | 10% FBS in basal media supplemented with L-glutamine, gentamicin and amphotericin |
| Accutase cell dissociation reagent | Life Technologies | A11105-01 | |
| ethanol | Sigma Aldrich | E7023-500ML | |
| fibronectin | Sigma Aldrich | F2006-1MG | |
| MMP1 DuoSet ELISA kit | R&D systems | DY901 | |
| HA ELISA kit | Echelon Biosciences | K-1200 | |
| PBS | Life Technologies | 14190-136 | |
| propidium iodide | Life Technologies | P1304MP | |
| Syto-13 | Life Technologies | S7575 | |
| QuantiTect reverse transcription kit | Qiagen | 205311 | |
| SYBR Green PCR master mix | Life Technologies | 4309155 | |
| replacement speaker | DAYTON audio (via Parts Express) |
DS90-8 | paper cone, full range (80-13000 Hz), 85dB |
| Ergo Micro torque screwdriver | Mountz | # 020377 | torque range: 20-120 cN.m |
| stereo speaker selector | RadioShack | 40-244 | maximum power handling 50 W |
| function generator | Agilent | 33220A | frequency range 1 µHz- 20 MHz |
| power amplifier | PYLE audio | PylePro PT2400 | frequency response: 10 Hz-50 kHz, two speaker channels |
| cell culture incubator | Thermo Fisher | Steri-Cult 3307 | |
| syringe pump | New Era Pump Systems | NE-300 | |
| High voltage power supply | Spellman | CZE 1000R | output voltage: 0-30 kV |
| scanning electron microscope | JEOL-USA | JSM-7400F | |
| desk gold sputter coater | Denton Vacuum | DSK00V-0013 | |
| Doppler laser vibrometer | Polytec | PDV-100 | non-contact velocity measurement (0-22 kHz) |
| PCR sequence detection system | Applied Biosystems | ABI7300 | |
| multiphoton confocal microscope | Zeiss | Zeiss 510Meta NLO | |
| UV-VIS Spectrophotometer | NanoDrop Products via Thermo Scientific |
ND-2000 | |
| VibSoft Data Acquisition Software | Polytec | acquisition bandwidth up to 40 MHz | |
| Origin 8.5 data analysis software | OriginLab | ||
| qbasePlus qPCR data analysis software | Biogazelle | V2.3 | |
| aluminium alloy | McMaster-Carr | Alloy 6061 | |
| acrylic blocks | McMaster-Carr | ||
| polycarbonate anti-humidity chamber | McMaster-Carr | Impact-Resistant Polycarbonate | |
| screws | McMaster-Carr | ||
| electronic cable/wire | |||
| medical grade PVC tubing | US Plastic Corp. | Tygon S-50-HL | clear, biocompatible |
| 10 mL syringe | Becton Dickinson | 309604 | |
| 21 G blunt ended needle | Small Parts | NE-213PL-25 | 1-1/2" length |
| Alligator clip adapters | RadioShack | 270-354 | fully insulated |
| 8 mm biopsy punch | Sklar Surgical Instruments | 96-1152 | sterile, disposable |
| 12 mm biopsy punch | Acuderm (via Fisher Scientific) | NC9998681 | |
| tissue culture flasks | Corning | cell culture treated |
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