Method Article

Dérivation sans chargeur-de cellules progénitrices de la crête neurale souches pluripotentes humaines cellules

DOI:

10.3791/51609

⸱

May 22nd, 2014

 ,  ,  , 
1Developmental Biology, Center for Stem Cell Biology, Sloan-Kettering Institute for Cancer Research, 2St. Giles Laboratory of Human Genetics of Infectious Diseases, The Rockefeller University

In This Article

Summary

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Crête neurale (NC) des cellules dérivées de cellules souches pluripotentes humaines (HPSC) ont un grand potentiel pour la modélisation du développement humain et de la maladie et des thérapies de remplacement cellulaire. Ici, une adaptation libre-alimentation de l'a largement utilisé In vitro Protocole de différenciation pour la dérivation de cellules NC de hPSCs est présenté.

Abstract

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Cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) ont un grand potentiel pour l'étude du développement embryonnaire humain, pour la modélisation des maladies humaines dans le plat et comme une source de cellules transplantables pour des applications de régénération après la maladie ou les accidents. Les cellules de la crête neurale (CN) sont les précurseurs pour une grande variété de cellules somatiques adultes, comme les cellules du système nerveux périphérique et les cellules gliales, les mélanocytes et les cellules mésenchymateuses. Ils sont une source précieuse de cellules pour étudier les aspects du développement embryonnaire humaine, y compris la spécification du destin cellulaire et la migration. En outre la différenciation de cellules progénitrices CN en types de cellules à différenciation terminale offre la possibilité de modéliser les maladies humaines in vitro, étudier les mécanismes de la maladie et de générer des cellules pour la médecine régénératrice. Cet article présente l'adaptation d'un protocole in vitro de différenciation actuellement disponibles pour la dérivation de cellules NC de hPSCs. Ce nouveau protocole nécessite 18 jours de différenciation, est facilement extensible et hautement reproductible entre cellules embryonnaires humaines (CSEh souches) des lignes ainsi que les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) des lignes sans chargeur. Les anciens et les nouveaux protocoles donnent des cellules NC de l'identité égale.

Introduction

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Cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et les cellules souches pluripotentes humaines induites (hiPSC) ont montré un immense potentiel, en particulier pour l'enquête et le traitement futur des maladies humaines, pour laquelle aucun des modèles animaux de bonnes ni de tissus primaires sont disponibles. Exemples d'applications pour la technologie CSEh / hiPSC sont les suivantes: les cellules d'intérêt particulier peuvent être générés à partir de CSEh / hiPSCs pour la médecine régénérative à une quantité illimitée. Les cellules peuvent être produites à partir de patients porteurs d'une maladie spécifique et utilisées pour établir des <....

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Protocol

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1. Préparation de milieux de culture, des boîtes recouvertes et entretien de hPSCs

Préparation 1.1 Médias

Remarque: Filtrez tous les médias pour la stérilisation et conserver à 4 ° C dans l'obscurité pendant 2 semaines. noms de réactifs, la société et numéros de catalogue sont répertoriés dans le tableau des matières.

  1. DMEM/10% de FBS: Mélanger 885 ml de DMEM, 100 ml de FBS, 10 ml Pen / Strep et 5 ml de L-glutamine.
  2. HES-moyen: Mélanger 800 ml DMEM/F12, 200 ml KSR, 5 ml de L-glutamine, 5 ml Pen / Strep, 10 ml de MEM minimum solution essentielle d'acides aminés, de 1 ml ....

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Results

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Les deux améliorations les plus importantes du protocole R-NC-dessus du protocole MS5-R-CN 11 sont les conditions de différenciation, définies libre-desserte et le raccourcissement global de l'exigence de délai. MS5 cellules nourricières 13 sont des cellules murines de moelle osseuse provenant stromales qui ont été présentés à l'appui différenciation neurale de CSEh 14. HESCs cultivées sur des cellules nourricières MS5 à former des structures épithéliales de faible densité et des rosette.......

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Discussion

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Pour la différenciation réussie de cellules R-NC de CSEh / hiPSCs les considérations suivantes doivent être prises. Il est essentiel de travailler dans des conditions de culture stériles à tout moment. En particulier, il est important de tester les cultures HPSC pour contamination par des mycoplasmes régulièrement, depuis cette contamination va entraver la différenciation réussie, mais ne peut pas être facilement détecté visuellement dans les cultures HPSC. La différenciation R-NC doit être instauré à la densité cellula.......

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Disclosures

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Les auteurs n'ont aucun intérêt à divulguer contradictoires.

Acknowledgements

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Ce travail a été soutenu par une bourse pour chercheurs avancés du Fonds national suisse de la science et par des subventions de NYSTEM (C026446; C026447) et l'initiative sur les cellules souches Tri-institutionnel (Fondation Starr).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
DMEMGibco-Life Technologies11965-092
Sérum fœtal de veau (FBS)Atlanta BiologicalsS11150
DMEM/F12Gibco-Life Technologies11330-032
Remplacement du sérum knockoutGibco-Life Technologies10828-028Le lot doit être testé
L-GlutamineGibco-Life Technologies25030-081
Pénicinline/StreptomycineGibco-Life Technologies15140-122
Solution d’acides aminés essentiels minimaux MEM  ;Gibco-Life Technologies11140-050
&beta ;-Mercaptoéthanol  ;Gibco-Life Technologies21985-023toxique
Recombinant humain FGF basique (FGF2)R& D Systems233-FB-001MG/CF
Knockout DMEMGibco-Life Technologies10829-018
DMEM/F12 poudre  ;Invitrogen12500-096
GlucoseSigmaG7021
Bicarbonate de sodium  ;SigmaS5761
APO transfert humainSigmaT1147
Insuline humaine  ;SigmaI2643
Dichlorhydrate de putriscineSigmaP5780
SéléniteSigmaS5261
ProgestéroneSigmaP8783
Matrigel matriceBD Biosciences354234
Poly-L Bromhydrate d’ornithineSigmaP3655
Laminine-I de sourisR& ampère; D Systems3400-010-01
FibronectineBD Biosciences356008
Dispase dans la solution saline équilibrée de Hank 5 U/mlStem Cell Technologies7013
Trypsine-EDTA  ;Gibco-Life Technologies25300-054
Y-27632 dichlorhydrateTocris-R& D Systems1254
LDN193189Stemgent04-0074
SB431542Tocris-R& D Systems1614
AccutaseInnovative Cell TechnologiesAT104
Acide ascorbique  ;SigmaA4034
BDNFR& D Systems248-BD
FGF8R& D Systems423-F8
Souris recombinante sonic hedgehog (SHH)R& D Systems464SH
HBSSGibco-Life Technologies14170-112
HEPESGibco-Life Technologies1563-080
EGF humain recombinantR& Gélatine D Systems236EG
(PBS sans Mg/Ca)interne
Anticorps :
Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgMSigmaC6680-100TSTle lot doit être testé
Anti-p75 mIgG1 (récepteur du facteur de croissance nerveuse)Advanced Targeting SystemsAB-N07le lot doit être testé
APC rat anti-mIgMBD Parmingen550676lot doit être testé
AlexaFluor 488 chèvre anti-souris IgG1  ;Le lot d’InvitrogenA21121doit être testé
Anti Oct4 mIgG2b (utilisé à une dilution de 1:200)Le lot Santa Cruzsc-5279doit être testé
Matériel/Équipement :
Fibroblastes embryonnaires de souris (7 millions de cellules/flacon)GlobalStemGSC-6105M
Boîtes de culture cellulaire : plaques de 10 cm et 15 cm, tubes à centrifuger, tubes FACS, pipettes, pipette
en verre
Centrifugeuse
Incubateur de culture cellulaire (CO2, humidité et température contrôlées)
Hotte à flux laminaire de culture cellulaire avec microscope
Capotde biosécurité pour la culture cellulaire
Trieuse cellulaire, i.e. MoFlo
Microscope
1 ml TB seringue 27Gx1/2BD Biosciences309623
Élévateur de cellules PolyéthylèneCorning Incorporated3008
Hématocytomètre de culture cellulaireintégréinversé

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
  2. Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature.

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Neural Crest Progenitor CellsHuman Pluripotent Stem CellsFeeder free DifferentiationFluorescence Activated Cell SortingNeural Rosette StageHNK 1 and p75 MarkersCell Migration AssayDefined Small MoleculesPoly L ornithin CoatingN2 Differentiation Medium

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