Feeder-fri Udledning af neurale Crest stamceller fra menneskelige pluripotente stamceller
Summary
Abstract
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) har et stort potentiale for at studere humane embryonale udvikling, til at modellere menneskelige sygdomme i skålen og som en kilde til transplanterbare celler til regenerativ applikationer efter sygdom eller ulykker. Neuralkam (NC)-celler er forløbere for et stort udvalg af voksne somatiske celler, såsom celler fra det perifere nervesystem og glia, melanocytter og mesenchymale celler. De er en værdifuld kilde til celler til at studere aspekter af den menneskelige embryonale udvikling, herunder celle skæbne specifikation og migration. En yderligere differentiering af NC progenitorceller i terminalt differentierede celletyper giver mulighed for at modellere humane sygdomme in vitro, undersøge sygdomsmekanismer og generere celler til regenerativ medicin. Denne artikel præsenterer en tilpasning af et aktuelt tilgængelige in vitro differentiering protokol for afledning af NC-celler fra hPSCs. Denne nye protokol kræver 18 dages forskelrentiation, er feeder-fri, let skalerbar og meget reproducerbar blandt humane embryonale stamceller (hESC) linjer såvel som menneskeskabte pluripotente stamceller (hiPSC) linjer. Både gamle og nye protokoller giver NC celler af samme identitet.
Introduction
Humane embryonale stamceller (hESC) og menneskelige inducerede pluripotente stamceller (hiPSC) har vist enorme potentiale, navnlig for undersøgelsen og fremtidige behandling af sygdomme hos mennesker, for hvilke der hverken god dyremodeller eller primære væv er tilgængelige. Applikationseksempler for embryonale / hiPSC teknologi er følgende: Celler af særlig interesse kan genereres fra hESC / hiPSCs for regenerativ medicin ved ubegrænset antal 1. Celler kan produceres fra patienter bærer en specifik sygdom og bruges til at etablere in vitro sygdomsmodeller 2,3. Sådanne sygdomsmodeller kan derefter anvendes til storstilet drug screening i søgen efter nye stofblandinger 4 samt afprøvning af eksisterende lægemidler til effekt og toksicitet 5.. In vitro sygdomsmodeller kan føre til identifikation af nye sygdomsmekanismer. For alle anvendelser af embryonale / IPSC teknologi er det vigtigt at arbejde med specifikke, vel-definered celletyper påvirket i sygdommen af interesse. Således er afgørende for alle applikationer i embryonale / hiPSC teknologi tilgængeligheden af faste og reproducerbare in vitro differentiering protokoller. Protokoller er ønskeligt, at vise minimal variabilitet, tid bekostning, indsats, besvær og omkostninger samt maksimal reproducerbarhed blandt embryonale / hiPSC linjer og forskellige forskere.
Neuralkam (NC)-celler der dukker op under hvirveldyr neurulation mellem epidermis og neurale epitel. De formere sig og migrere udstrakt grad i hele embryo under udvikling og giver anledning til en imponerende mangfoldighed af afkom celletyper, herunder knogle / brusk, den craniofacial skelet, følenerver, Schwann celler, melanocytter, glatte muskelceller, enteriske neuroner, det autonome neuroner, kromaffinceller , hjerte-septum celler, tænder og binyre / skjoldbruskkirtlen kirtelceller 6. Således NC celler er en attraktiv celletype for feltet stamceller og er vigtige formodellering af en række sygdomme, såsom Hirschsprungs sygdom 7, familiær dysautonomi 8 såvel som cancere, såsom neuroblastom 9. Desuden tilbyder de muligheden for at studere aspekter af den menneskelige embryonale udvikling in vitro.
Den aktuelt tilgængelige og almindeligt anvendt in vitro differentiering protokol for afledning af NC-celler fra hESCs 10,11 kræver op til 35 dage om differentiering og det indebærer neurale induktion på stroma feederceller såsom MS5 celler og er derfor udføres under dårligt definerede betingelser. Selv om det kan være op-skaleret til at generere store mængder af NC-celler, for eksempel kræves for high-throughput drug screening 4, dette er arbejdskraft og omkostningskrævende. Desuden indebærer det manuel passage af neurale rosetter, hvilket kan være svært at gengive, og dermed er underlagt samlede variabilitet, især når det anvendes på et stort udvalg af hESC eller hiPSClinjer. Her er den trinvise afledning af NC-celler i en 18-dages-protokol, der er fri for feeder celler vist. Denne metode er kortere og mere defineret end den aktuelt anvendte protokol. Desuden er det meget robust generere NC celler mellem forskellige hiPSC linjer. Vigtigere er det vist, at NC-celler fremkommet ved begge protokoller dukke op ved grænsen af neurale rosetter (herefter betegnet roset-NC eller R-NC). De celler, der stammer enten ved hjælp af de to protokoller ser morfologisk identiske, de udtrykker den samme NC-markører og klynge sammen i microarray analyse. NC-celler afledt ved hjælp af den nye protokol (R-NC) er funktionelle, svarende til NC-celler afledt ved hjælp af den gamle protokol (MS5-R-NC), således at de kan migrere og yderligere differentiere i neuroner. Derfor kan cellerne anvendes samtidig med MS5-R-NC-celler. R-NC celle protokol til afledning af NC-celler fra embryonale / IPSC vil være nyttige for alle applikationer i embryonale / IPSC teknologi involverer NC afstamning. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
For en vellykket differentiering af R-NC-celler fra hESC / hiPSCs følgende overvejelser bør gøres. Det er vigtigt at arbejde under sterile dyrkningsbetingelser på alle tidspunkter. I særdeleshed er det vigtigt at teste hPSC kulturer for forurening med mycoplasma jævnligt, da denne forurening vil hindre vellykket differentiering, men kan ikke let kan påvises visuelt hPSC kulturer. Bør indledes R-NC differentiering på 90-100% celletæthed; lavere celletæthed påvirker cellernes overlevelse og effektiviteten af ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af et stipendium for avancerede forskere fra den schweiziske National Science Foundation og gennem tilskud fra NYSTEM (C026446, C026447) og Tri-institutionelle initiativ stamcelle (Starr Foundation).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
