Feeder fria Härledning av neurallisten progenitorceller från Human pluripotenta stamceller
Summary
Abstract
Mänskliga pluripotenta stamceller (hPSCs) har stor potential för att studera mänskliga embryonala utveckling, för modellering av mänskliga sjukdomar i skålen och som en källa till transplanterbara celler för regenerativa applikationer efter sjukdom eller olycksfall. Neurallisten (NC)-celler är de prekursorer för en stor variation av vuxna somatiska celler, såsom celler från det perifera nervsystemet och glia, melanocyter och mesenkymala celler. De är en värdefull källa av celler för att studera aspekter av mänsklig embryonal utveckling, inklusive cell öde specifikation och migration. Ytterligare differentiering av NC progenitorceller i terminalt differentierade celltyper erbjuder möjligheten att modellera mänskliga sjukdomar in vitro, undersöka sjukdomsmekanismer och generera celler för regenerativ medicin. I denna artikel presenteras en anpassning av en för närvarande tillgänglig in vitro differentiering protokoll för härledning av NC-celler från hPSCs. Detta nya protokoll kräver 18 dagars differentiation är feeder-fri, skalbar och mycket reproducerbar bland mänskliga embryonala stamceller (hESC) linjer samt mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) linjer. Både gamla och nya protokoll ger NC-celler med samma identitet.
Introduction
Mänskliga embryonala stamceller (hESC) och mänskliga inducerade pluripotenta stamceller (hiPSC) har visat enorm potential, särskilt för utredningen och framtida behandling av mänskliga sjukdomar för vilka varken bra djurmodeller eller primära vävnader finns tillgängliga. Applikationsexempel för hESC / hiPSC teknik är följande: Celler av särskilt intresse kan genereras från hESC / hiPSCs för regenerativ medicin vid obegränsad mängd 1. Celler kan tillverkas av patienter som bär en specifik sjukdom och användas för att fastställa in vitro-sjukdomsmodeller 2,3. Sådana sjukdomsmodeller kan sedan användas för storskalig drogscreening i jakten på nya läkemedelssubstanser 4 samt testning av existerande läkemedel för effektivitet och toxicitet 5. In vitro sjukdomsmodeller kan leda till identifiering av mekanismer nya sjukdoms. För alla tillämpningar av stamceller från mänskliga embryon / iPSC teknik är det viktigt att arbeta med specifika, väl definierad celltyper som påverkas i sjukdomen av intresse. Således är avgörande för alla tillämpningar av stamceller från mänskliga embryon / hiPSC teknik tillgången på fasta och reproducerbara in vitro differentieringsprotokoll. Protokoll är önskvärt att visa minimal variation, tids kostnad, ansträngning, svårighet och kostnad samt maximal reproducerbarhet bland hESC / hiPSC linjer och olika forskare.
Neurallisten (NC)-celler växa under vertebrat neurulation mellan epidermis och det neurala epitelet. De förökar sig och migrera mycket i hela det växande embryot och ge upphov till en imponerande mångfald av typer avkomma cell, inklusive ben / brosk, den kraniofaciala skelettet, sensoriska nerver, Schwann celler, melanocyter, glatta muskelceller, enterala neuroner, autonoma nervceller, kromaffinceller , hjärt septum celler, tänder och adrenal / sköldkörtelkörtelceller 6. Sålunda NC-celler är en attraktiv celltyp för stamcells fältet och viktigt förmodellering av en mängd olika sjukdomar, till exempel Hirschsprungs sjukdom 7, Familial Dysautonomia 8 samt cancrar såsom neuroblastom 9. Dessutom erbjuder de en möjlighet att studera aspekter av mänsklig embryonal utveckling in vitro.
Den nu tillgängliga och i stor utsträckning in vitro differentiering protokoll för härledning av NC-celler från hESCs 10,11 kräver upp till 35 dagar av differentiering och det innebär neurala induktion på stromaceller feeder celler såsom MS5 celler och därför utförs under dåligt definierade villkor. Även om det kan skalas upp för att generera stora kvantiteter av NC-celler, exempelvis krävs för high-throughput drug screening 4, är detta arbets-och kostnadsintensiv. Dessutom handlar det om manuell passage av neurala rosetter, som kan vara svåra att reproducera och därmed är föremål för totala variabiliteten, i synnerhet när det tillämpas på en stor variation av stamceller från mänskliga embryon eller hiPSClinjer. Här är den stegvis härledning av NC-celler i en 18-dagars protokoll som är fri från feeder-celler visas. Denna metod är kortare och mer definierat än det för närvarande använda protokoll. Vidare är det mycket robust i att generera NC-celler hos olika hiPSC linjer. Viktigt är det visat att NC-celler som uppkommer genom båda protokollen fram vid gränsen av neurala rosetter (nedan benämnd rosett-NC eller R-NC). Cellerna härledda med hjälp av någon av de två protokollen ser morfologiskt identiska, de uttrycker samma NC-markörer och kluster tillsammans i microarray analys. NC-celler som härrör använda det nya protokollet (R-NC) är funktionella, liknar NC celler härledda med hjälp av gamla protokoll (MS5-R-NC) så att de kan migrera och ytterligare differentiera till neuroner. Därför kan cellerna användas samtidigt med de MS5-R-NC-celler. Den R-NC-cell protokoll för härledning av NC-celler från stamceller från mänskliga embryon / iPSC kommer att vara användbart för alla tillämpningar av stamceller från mänskliga embryon / iPSC teknik involverar NC härstamning. </ P>
Protocol
Representative Results
Discussion
För framgångsrik differentiering av R-NC-celler från hESC / hiPSCs följande överväganden göras. Det är viktigt att arbeta under sterila odlingsförhållanden vid alla tillfällen. I synnerhet är det viktigt att testa HPSC kulturer för mykoplasmkontaminering regelbundet, eftersom denna kontaminering kommer att hindra framgångsrik differentiering, men inte lätt kan detekteras visuellt i HPSC kulturer. Den R-NC differentiering bör inledas med 90-100% celltäthet; lägre celltäthet påverkar cellöverlevnad oc…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete fick stöd av ett stipendium för avancerade forskare från Swiss National Science Foundation och genom bidrag från NYSTEM (C026446, C026447) och Tri-institutionella stamcellsinitiativ (Starr Foundation).
Materials
| Regents | company | cataloge number | comments |
| DMEM | Gibco-Life Technologies | 11965-092 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| DMEM/F12 | Gibco-Life Technologies | 11330-032 | |
| Knockout Serum Replacement | Gibco-Life Technologies | 10828-028 | Lot should be tested |
| L-Glutamine | Gibco-Life Technologies | 25030-081 | |
| Penicinlin/Streptomycin | Gibco-Life Technologies | 15140-122 | |
| MEM minimum essential amino acids solution | Gibco-Life Technologies | 11140-050 | |
| β-Mercaptoethanol | Gibco-Life Technologies | 21985-023 | toxic |
| Recombinant human FGF basic (FGF2) | R&D Systems | 233-FB-001MG/CF | |
| Knockout DMEM | Gibco-Life Technologies | 10829-018 | |
| DMEM/F12 powder | Invitrogen | 12500-096 | |
| Glucose | Sigma | G7021 | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S5761 | |
| APO human transferrin | Sigma | T1147 | |
| Human insulin | Sigma | A4034 | |
| Putriscine dihydrochloride | Sigma | P5780 | |
| Selenite | Sigma | S5261 | |
| Progesterone | Sigma | P8783 | |
| Matrigel matrix | BD Biosciences | 354234 | |
| Poly-L Ornithin hydrobromide | Sigma | P3655 | |
| Mouse Laminin-I | R&D Systems | 3400-010-01 | |
| Fibronectin | BD Biosciences | 356008 | |
| Dispase in Hank's Balanced Salt Solution 5U/ml | Stem Cell Technologies | 7013 | |
| Trypsin-EDTA | Gibco-Life Technologies | 25300-054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris-R&D Systems | 1254 | |
| LDN193189 | Stemgent | 04-0074 | |
| SB431542 | Tocris-R&D Systems | 1614 | |
| Accutase | Innovative Cell Technologies | AT104 | |
| Ascorbic Acid | Sigma | A4034 | |
| BDNF | R&D Systems | 248-BD | |
| FGF8 | R&D Systems | 423-F8 | |
| Mouse recombinant sonic hedgehog (SHH) | R&D Systems | 464SH | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Atlanta Biologicals | S11150 | |
| HBSS | Gibco-Life Technologies | 14170-112 | |
| HEPES | Gibco-Life Technologies | 1563-080 | |
| Human recombinant EGF | R&D Systems | 236EG | |
| gelatin (PBS without Mg/Ca) | in house | ||
| Antibodies: | |||
| Anti HNK-1/N-Cam (CD57) mIgM | Sigma | C6680-100TST | lot should be tested |
| Anti-p75 mIgG1 (Nerve Growth factor receptor) | Advanced Targeting Systems | AB-N07 | lot should be tested |
| APC rat anti-mIgM | BD Parmingen | 550676 | lot should be tested |
| AlexaFluor 488 goat anti-mouse IgG1 | Invitrogen | A21121 | lot should be tested |
| Anti Oct4 mIgG2b (used at 1:200 dilution) | Santa Cruz | sc-5279 | lot should be tested |
| Material/Equipment: | |||
| Mouse embryonic fibroblasts (7 million cells/vial) | GlobalStem | GSC-6105M | |
| Cell culture dishes: 10cm and 15 cm plates, centrifuge tubes, FACS tubes, pipetts, pipet tips | |||
| Glass hematocytometer | |||
| Cell culture centrifuge | |||
| Cell culture incubator (CO2, humidity and temperature controlled) | |||
| Cell culture laminar flow hood with embedded microscope | |||
| Cell culture biosafety hood | |||
| Cell sorting machine, i.e. MoFlo | |||
| Inverted microscope | |||
| 1 ml TB syringe 27Gx1/2 | BD Biosciences | 309623 | |
| Cell lifter Polyethylene | Corning Incorporated | 3008 |
References
- Lee, G., Studer, L. Induced pluripotent stem cell technology for the study of human disease. Nat Methods. 7, 25-27 (2010).
- Lee, G., et al. Modelling pathogenesis and treatment of familial dysautonomia using patient-specific iPSCs. Nature. 461, 402-406 (2009).
- Ebert, A. D., et al. Induced pluripotent stem cells from a spinal muscular atrophy patient. Nature. 457, 277-280 (2009).
- Lee, G., et al. Large-scale screening using familial dysautonomia induced pluripotent stem cells identifies compounds that rescue IKBKAP expression. Nat Biotechnol. 30, 1244-1248 (2012).
- Zimmer, B., et al. Evaluation of developmental toxicants and signaling pathways in a functional test based on the migration of human neural crest cells. Environ Health Perspect. 120, 1116-1122 (2012).
- Dupin, E., Sommer, L. Neural crest progenitors and stem cells: from early development to adulthood. Dev Biol. 366, 83-95 (2012).
- McKeown, S. J., Stamp, L., Hao, M. M., Young, H. M. Hirschsprung disease: a developmental disorder of the enteric nervous system. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2, 113-129 (2013).
- Slaugenhaupt, S. A., et al. Tissue-specific expression of a splicing mutation in the IKBKAP gene causes familial dysautonomia. Am J Hum Genet. 68, 598-605 (2001).
- Cheung, N. K., Dyer, M. A. Neuroblastoma: developmental biology, cancer genomics and immunotherapy. Nat Rev Cancer. 13, 397-411 (2013).
- Lee, G., et al. Isolation and directed differentiation of neural crest stem cells derived from human embryonic stem cells. Nat Biotechnol. 25, 1468-1475 (2007).
- Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Derivation of neural crest cells from human pluripotent stem cells. Nat Protoc. 5, 688-701 (2010).
- Chambers, S. M., et al. Highly efficient neural conversion of human ES and iPS cells by dual inhibition of SMAD signaling. Nat Biotechnol. 27, 275-280 (2009).
- Itoh, K., et al. Reproducible establishment of hemopoietic supportive stromal cell lines from murine bone marrow. Exp Hematol. 17, 145-153 (1989).
- Barberi, T., et al. Neural subtype specification of fertilization and nuclear transfer embryonic stem cells and application in parkinsonian mice. Nat Biotechnol. 21, 1200-1207 (2003).
- Elkabetz, Y., et al. Human ES cell-derived neural rosettes reveal a functionally distinct early neural stem cell stage. Genes Dev. 22, 152-165 (2008).
- Mica, Y., Lee, G., Chambers, S. M., Tomishima, M. J., Studer, L. Modeling neural crest induction, melanocyte specification, and disease-related pigmentation defects in hESCs and patient-specific iPSCs. Cell Rep. 3, 1140-1152 (2013).
- Molofsky, A. V., et al. Bmi-1 dependence distinguishes neural stem cell self-renewal from progenitor proliferation. Nature. 425, 962-967 (2003).
