Kombineret optisk og μCT billeddannelse i en musemodel af ortopædisk implantat infektion ved anvendelse af en bioluminescerende manipuleret stamme af Staphylococcus aureus, forudsat at evnen til ikke-invasivt og i længderetningen overvåge dynamik bakteriel infektion, såvel som den tilsvarende inflammatoriske respons og anatomiske ændringer i knogle.
Multimodalitet imaging er opstået som en fælles teknologisk fremgangsmåde, der anvendes i både præklinisk og klinisk forskning. Avancerede teknikker, der kombinerer in vivo optiske og μCT billeddannelse tillader visualisering af biologiske fænomener i en anatomisk sammenhæng. Disse billeddannende modaliteter kan være særligt nyttigt at undersøge forhold, der påvirker knogle. Navnlig ortopædiske implantat infektioner er et stort problem i klinisk ortopædisk kirurgi. Disse infektioner er vanskelige at behandle, fordi bakterielle biofilm dannes på de udenlandske kirurgisk implanterede materialer, hvilket fører til vedvarende inflammation, osteomyelitis og eventuel osteolyse af knoglen omkring implantatet, hvilket i sidste ende resulterer i implantatet løsner og fiasko. Her blev en musemodel for en inficeret ortopædisk proteseimplantat anvendes der involverede den kirurgiske placering af en Kirschner-tråd implantatet i en intramedullær kanal i lårbensknoglen på en sådan måde, at den ende af implantatet eXtended i knæleddet. I denne model, LysEGFP mus, en muse-stamme, der har EGFP-fluorescerende neutrofiler, blev anvendt i forbindelse med en bioluminescerende Staphylococcus aureus stamme, der naturligt udsender lys. Bakterierne blev inokuleret i knæleddene fra musene forud for lukning af operationsstedet. In vivo bioluminescerende og fluorescerende billeddannelse blev anvendt til at kvantificere den bakterielle belastning og neutrofil inflammatorisk respons hhv. Desuden blev μCT billeddannelse udført på den samme mus, så at 3D placeringen af bioluminescerende og fluorescerende optiske signaler kunne co-registreret med de anatomiske μCT billeder. For at kvantificere ændringerne i knoglen over tid, blev den ydre knogle volumen af den distale lårben, målt ved specifikke tidspunkter ved hjælp af en semi-automatisk kontur baseret segmentering proces. Taget sammen, kombinationen af in vivo bioluminiscente / fluorescerende billeddannelse med μCT billeddiagnostik kan være særligt nyttigt feller ikke-invasiv overvågning af infektion, inflammatorisk respons og anatomiske ændringer i knoglen over tid.
Multimodalitet præklinisk billeddannende teknikker, der inddrager en kombination af optiske og anatomiske oplysninger tillader visualisering og overvågning af biologiske fænomener i 3D 1-4. Da μCT billeddannelse tillader udsøgte visualisering af knogle anatomi ved hjælp μCT billeddannelse i konjunktion med optisk afbildning repræsenterer en unik kombination, der kan være særligt nyttigt for at undersøge processer, der involverer knoglebiologien 5-7. Et eksempel kunne være at bruge disse teknikker til at studere ortopædiske implantat infektioner, som repræsenterer en katastrofal komplikation efter ortopædiske kirurgiske procedurer 8,9. Bakterier biofilm dannes på de implanterede fremmedlegemer, der fremmer overlevelse af bakterierne ved at fungere som en fysisk barriere, der forhindrer immunceller fra sensing infektion og blokerer antibiotika i at få adgang bakterierne 10,11. Den kroniske og vedvarende infektion af den fælles væv (septisk arthritis) end knogle (osteomyelitis) inducerer knogleresorption, der fører til at løsne af protesen og eventuel fiasko 8,9. Det resulterende omkring protesen osteolyse er forbundet med øget sygelighed og dødelighed 12,13.
I vores tidligere arbejde, blev in vivo selvlysende og fluorescerende billeddannelse anvendes sammen med X-ray og mikro-computertomografi imaging (μCT) i en ortopædisk protese fælles infektion model i mus 14-19. Involverede Denne model placerer en titanium Kirschner-tråd (K-tråd) på en sådan måde, at den afskårne ende af implantatet udvides i knæleddet fra lårben af mus 14-19. Et inoculum af Staphylococcus aureus (bioluminescerende stamme Xen29 eller Xen36) blev derefter pipetteret på overfladen af implantatet i knæleddet før det kirurgiske sted blev lukket 14-19. In vivo optisk billeddannelse blev anvendt til at detektere og kvantificere de bioluminescerende signaler, som svarede til number af bakterier i den inficerede led og knoglevæv 14-19. Desuden in vivo fluorescensimagografi af LysEGFP mus, som besidder fluorescerende neutrofiler 20, blev anvendt til at kvantificere antallet af neutrofiler, som udvandrede til de inficerede knæled indeholdende K-wire implantater 14,19. Endelig anatomiske billeddiagnostiske metoder, herunder høj opløsning røntgenbilleder og μCT billedbehandling, tilladte respektive 2D og 3D anatomisk billeddannelse i den berørte knogle over hele varigheden af kronisk infektion, som vi vilkårligt ville ende typisk mellem 2 og 6 postoperative uger 16 18. Ved hjælp af denne model, kan effekten af lokal og systemisk antimikrobiel terapi, beskyttende immunrespons og patologiske anatomiske forandringer i knogle evalueres 14-18. I dette manuskript blev de detaljerede protokoller for de optiske og μCT afbildningsmodaliteter i denne ortopædisk protese fælles infektion modellen som en representative system til at studere de biologiske processer i den anatomiske sammenhæng af knoglen. Disse omfatter de kirurgiske procedurer til at modellere en ortopædisk protese fælles infektion i mus, 2D og 3D i vivo optisk billeddiagnostiske procedurer (for at påvise bakterielle bioluminiscerende signaler og fluorescerende neutrofile signaler), μCT billedbehandling erhvervelse og analyse, og co-registrering af 3D optiske billeder med μCT billeder.
Multimodalitet billeddannelse som billeddannende teknikker, der udnytter in vivo optisk billeddannelse i forbindelse med μCT billedbehandling giver en ny teknologisk tilgang, der gør det muligt for 3D-visualisering, kvantificering og langsgående overvågning af biologiske processer i en anatomisk sammenhæng 1-4. Protokollerne i denne undersøgelse giver detaljerede oplysninger om, hvordan in vivo selvlysende og fluorescerende billeddannelse kan kombineres med μCT billeddannelse i et ortopædisk proteseimplantat infektion model i mus til at overvåge den bakterielle byrde, neutrofil inflammation og anatomiske forandringer i knoglen ikke-invasivt og langs over tid. Tilsammen oplysninger indhentet ved at kombinere optisk og strukturel billeddannelse repræsenterer et stort teknologisk fremskridt, som kan være særligt velegnet til at studere biologiske processer og patologiske tilstande, der påvirker bevægeapparatet.
En interesseing konstatering af, at skal påpeges, er, at vi observeret, at EGFP-neutrofil fluorescerende signaler faldt til baggrundsniveauer af 14-21 dage og forblev på baggrundsniveauer for varigheden af forsøget på trods af tilstedeværelsen af selvlysende bakterier. Det er usandsynligt, at røntgenbestråling påvirket neutrofil overlevelse som vi bemærkede lignende kinetik neutrofile signaler i ikke-bestrålede mus 19. I vores tidligere arbejde, der involverer en model af S. aureus inficerede sår, neutrofil infiltration er en kombination af en robust neutrofilrekruttering fra kredsløbet, langvarig neutrofil overlevelse på stedet for infektion og målsøgning af KIT + progenitorceller til absces, hvor de lokalt giver anledning til modne neutrofiler 23. Det er sandsynligt, at lignende processer bidrog til neutrofil infiltration i det ortopædiske implantat S. aureus infektion model. Selv om det er ukendt, hvorfor de neutrofile signaler faldt i Orthopaedic infektion model, kan det være, at immunresponset ændres over tid, da denne infektion har udviklet sig fra en akut til kronisk infektion, og dette er en genstand for fremtidig undersøgelse.
Der er begrænsninger med denne musemodel af ortopædiske proteser fælles infektion og in vivo multimodale billeddannelse, der bør bemærkes. Først denne musemodel er en oversimplificering af de faktiske procedurer og materialer i ortopædisk kirurgi i mennesker 24. Ikke desto mindre, denne model gør rekapitulere kronisk infektion og efterfølgende betændelse i knoglen og fælles væv, der er set i menneskelige ortopædiske implantat infektioner 8,9. Hertil kommer, at opnå de μCT billeder, var relativt lave doser af røntgenstråling til at minimere eventuelle negative virkninger på sundheden hos de dyr i løbet af infektionen. For bedre opløsning af ben, højere doser af røntgenstråling kunne anvendes til μCT billeddannelse på aflivet ennimals. Men det ville fjerne evnen til ikke-invasivt og i længderetningen overvåge knogleforandringer over varigheden af forsøgene.
Sammenfattende har multimodalitet billeddannelse involverer kombinationen af in vivo hele dyret optisk billeddannelse med anatomisk μCT billeddannelse tilladt mere omfattende information om den infektion og inflammatorisk reaktion. Desuden har disse teknikker tillader evaluering af følgerne af infektion og betændelse i knogler og led væv. Det fremtidige arbejde vil kunne drage fordel af multimodalitet billeddannelse at evaluere effekten af antimikrobielle behandlinger, immunreaktioner, patogenese af sygdomme og de reaktive forandringer i knoglen, som vi er begyndt at undersøge 14-18. Desuden kunne multimodale billeddannelse evaluere prober og sporstoffer til at diagnosticere tilstedeværelsen af en infektion som tidligere beskrevet i dyremodeller låret infektion, endocarditis, pulmonal inficererioner og biomateriale infektioner 25-28. Endelig kan brugen af multimodale billeddannelse udvides ud over smitsomme sygdomme og anvendes på tværs af discipliner, herunder ortopædi, reumatologi og onkologi, for at undersøge andre forhold, der påvirker bevægeapparatet, såsom skelet kræft, metastatisk sygdom, knoglebrud og gigt 5-7 .
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af en H & H Lee Kirurgisk Resident Research Scholars Program (til JAN), en AO Foundation starttilskud S-12-03M (til LSM) og et National Institutes of Health tilskud R01-AI078910 (til LSM) .
Xen36 bioluminescent Staphylococcus aureus strain | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Bioluminescent Staphylococcus aureus strain derived from ATCC 49525 (Wright), a clinical isolate from a bacteremia patient | |
Tryptic soy broth | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 211825 | |
Bacto Soy Agar | BD Biosciences, Franklin Lakes, NJ | 214010 | |
LysEGFP knockin mouse strain | Not commercially available. This strain contains a knockin of enhanced green fluorescence protein (EGFP) into the lysozyme M gene | ||
Betadine | Purdue Products, Stamford, CT | ||
Kirschner-wire (titanium, 0.8 mm diameter) | Synthes, West Chester, PA | 492.08 | |
Wire Cutter – Duracut T.C. | H&H Company, Ontario, Canada | 83-7002 | |
Isoflurane | Baxter, Deerfield, IL | 118718 | |
Vicryl 5-0 sutures (P-3 Reverse cutting) | Ethicon, Summerville, NJ. Purchased through VWR International. | 95056-936 | |
Sustained-release Buprenorphine (5 ml – 1 mg/ml) | Zoopharm, Windsor, CO | analgesic | |
IVIS Spectrum Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | optical in vivo imaging system | |
Quantum FX in vivo μCT system | PerkinElmer, Hopkinton, MA | μCT in vivo imaging system | |
IVIS SpectrumCT Imaging System | PerkinElmer, Hopkinton, MA | combined optical and μCT in vivo imaging system | |
Living Image Software | PerkinElmer, Hopkinton, MA | Image analysis software for in vivo optical imaging |