Metoder til karakterisering Spontan og overraske-induceret Locomotion i en Rotenon-induceret Parkinsons sygdom Model<em> Drosophila</em

Summary

Parkinsons sygdom er en neurodegenerativ lidelse, der resulterer fra degenerering af dopaminerge neuroner i centralnervesystemet, der forårsager bevægelseskomponenter defekter. Rotenon modeller Parkinsons sygdom i Drosophila. Dette papir beskriver to analyser, der kendetegner både spontane og startle-inducerede bevægelseskomponenter mangler forårsaget af rotenon.

Abstract

Parkinsons sygdom er en neurodegenerativ lidelse, der resulterer fra degenerering af dopaminerge neuroner i centralnervesystemet, især i substantia nigra. Sygdommen forårsager motoriske mangler, som præsenterer som stivhed, rystelser og demens hos mennesker. Rotenon er et insekticid, der forårsager oxidativ skade ved at inhibere funktionen af ​​elektron transportkæde i mitokondrierne. Det er også bruges til at modellere Parkinsons sygdom i Drosophila. Fluer har en iboende negativ geotactic svar, som tvinger dem til at klatre opad efter at være blevet forskrækket. Det er blevet fastslået, at rotenon forårsager tidlig dødelighed og bevægelseskomponenter fejl, der forstyrrer fluerne evne til at klatre, efter at de er blevet tappet nedad. Imidlertid er effekten af ​​rotenon på spontan bevægelse ikke veldokumenteret. Denne undersøgelse skitserer to følsomme, reproducerbare, og analyser med høj kapacitet til at karakterisere Rotenon-induceret mangler ikortsigtet startle-induceret bevægelse og langvarig spontan bevægelse i Drosophila. Disse analyser kan nemt tilpasses til at karakterisere andre Drosophila modeller af bevægelseskomponenter fejl og effekten af terapeutiske midler.

Introduction

Locomotion mangler er en vigtig symptom på Parkinsons sygdom og er i vid udstrækning skyldes forringelse af dopaminerge neuroner i substantia nigra ^1. Rotenon er en ketonisk insekticid, der er blevet undersøgt grundigt at modellere Parkinsons motoriske underskud i Drosophila ^2-6. Rotenon forårsager oxidative skader ved at blokere den oxidative phosphorylering vej, hvilket i sidste ende forårsager celledød ^7. Dopaminerge neuroner er mere tilbøjelige til rotenon toksicitet, hvilket gør virkningen af kemikaliet primært motor baseret ^2,7. Ved at inducere symptomer på Parkinsons sygdom i fluer, kan vi bedre forstå sygdommen og afhjælpe dens symptomer ^6,8-11. Drosophila giver en god model til at studere denne effekt, fordi de er genetisk medgørlig, let at vedligeholde, og har en hurtig livscyklus.

Adskillige undersøgelser har vist, at rotenon forårsager kortvarig chok-induceretbevægelseskomponenter defekter i Drosophila -når fluer vedligeholdes på rotenon-suppleret mad, de viser en langsommere negativ geotactic respons efter forskrækkelse ^2-6. Deres manglende evne til at klatre opad i et hætteglas apparat så hurtigt som kontrolforsøg er tegn på forskrækkelseskasser-induceret bevægelseskomponenter defekter.

Effekten af rotenon på langsigtet, er spontan bevægelse ikke velbeskrevet. Drosophila aktivitet monitorer (dæmninger) med succes er blevet anvendt til at overvåge bevægelse i Drosophila døgnrytme undersøgelser ^12,13. Fluer er placeret i de enkelte rør, der er indlæst i dæmningen. Dette apparat er udstyret med en infrarød sensor, der tæller antallet af gange en flue bryder den infrarøde stråle. Disse tællinger kan bruges som et mål for uforstyrret bevægelse og aktivitet ^12,13. Ved at placere fluer i et DAM, kan effekten af ​​rotenon på deres langsigtede bevægelse karakteriseres. Undersøgelsen beskriver metoder til at measURE kortsigtet startle-induceret bevægelse og langvarig spontan bevægelse for bedre at forstå virkningerne af rotenon medieret motoriske mangler. Karakterisering af bevægelseskomponenter mangler efterligner Parkinsons sygdom er vigtige, fordi de giver mulighed for undersøgelse af andre forbindelser, der kan vende disse bevægelseskomponenter defekter.

Protocol

1. Drosophila Startle-induceret Locomotion assay Drug Treatment Adstadige at immobilisere ønskede antal (ca. 8-12) på 1-3 dage gammel mand fluer ved hjælp af CO 2 og transportere dem til hætteglas indeholdende lægemidlet-suppleret fødevarer. Bemærk: En anden bedøvelsesmiddel fx kan æter eller is bruges til at bedøve fluer at muliggøre optælling og håndtering. Tillad fluer til at inddrive fra sedation i 20 min (eller indtil nyttiggørelse) med hætte…

Representative Results

Drosophila Startle-induceret Locomotion assay Vildtype, kanton-S, fluer viste en robust negativ geotactic respons med kun cirka 88% og 5% af fluer i den øverste og nederste sektioner henholdsvis af dobbelt-hætteglasset apparat efter 30 sek (figur 1). Fluer udsat for 125 m og 250 um rotenon 3 dage viste et lille fald i antallet af fluer i den øverste del og svag stigning i antallet af fluer i nederste sektion. Fluer udsat for 500 uM roten…

Discussion

I denne undersøgelse beskriver vi to procedurer for måling af både langsigtede spontan bevægelse og kortsigtede chok-induceret bevægelse i en rotenon-induceret Drosophila model af Parkinsons sygdom. Man kan også måle disse bevægelseskomponenter karakteristika fluer udsat for andre farmakologiske midler, der vides at modellere Parkinsons sygdom f.eks paraquat ¹⁴ genetiske modeller af Parkinsons sygdom fx alfa-synuclein mutanter ¹⁵ og andre flyve modeller af sygdomm…

Materials

Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5X65 mm
Recipe for Rotenone +food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO
			For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.