Metoder for å karakter Spontan og skremme-indusert Locomotion i en Rotenon-indusert Parkinsons sykdom Modell av<em> Drosophila</em

Summary

Parkinsons sykdom er en nevrodegenerativ lidelse som er et resultat av degenerasjon av dopaminerge neuroner i sentralnervesystemet, forårsaker locomotion defekter. Rotenon modeller Parkinsons sykdom i Drosophila. Dette notatet skisserer to analysene som preger både spontane og skremme-indusert locomotion mangler forårsaket av rotenon.

Abstract

Parkinsons sykdom er en nevrodegenerativ lidelse som er et resultat av degenerasjon av dopaminerge neuroner i sentralnervesystemet, primært i substantia nigra. Sykdommen forårsaker motor mangler, som presenterer som stivhet, skjelvinger og demens hos mennesker. Rotenon er et insekticid som fører til oksidativ skade ved å hemme funksjon av elektrontransportkjeden i mitokondriene. Det er også brukt til å modellere Parkinsons sykdom i Drosophila. Fluer har en iboende negativ geotactic respons, som tvinger dem til å klatre oppover etter å ha blitt skremt. Det er fastslått at rotenon forårsaker tidlig dødelighet og locomotion defekter som forstyrrer fluene 'evne til å klatre etter at de har blitt tappet ned. Imidlertid, er effekten av rotenon på spontan bevegelse ikke godt dokumentert. Denne studien skisserer to sensitive, reproduserbare, og høy gjennomstrømning analyser for å karakterisere rotenon-indusert mangler ikortsiktig skremme-indusert bevegelse og langsiktig spontan bevegelse i Drosophila. Disse assays kan enkelt tilpasses for å karakterisere andre Drosophila modeller for bevegelse defekter og effekten av terapeutiske midler.

Introduction

Bevegelse manglene er et viktig symptom av Parkinsons sykdom, og er i stor grad forårsaket av forverringen av dopaminerge neuroner i substantia nigra ^1. Rotenon er en ketonic insektmiddel som har blitt studert inngå å modellere Parkinsons motoriske mangler i Drosophila ^2-6. Rotenon fører til oksidativ skade ved å blokkere oksidativ fosforylering svei, som til slutt fører til celledød ^7. Dopaminerge nevroner er mer utsatt for rotenon toksisitet, noe som gjør virkningen av den kjemiske primært motoren basert ^2,7. Ved å fremkalle Parkinsons sykdom symptomer i fluer, kan vi bedre forstå sykdommen og utbedre sine symptomer ^6,8-11. Drosophila gir en god modell for å studere denne effekten fordi de er genetisk medgjørlig, lett å vedlikeholde, og har en rask livssyklus.

Flere studier har vist at rotenon fører kortsiktig skremme-indusertlocomotion defekter i Drosophila-når fluer er opprettholdt på rotenon-supplert mat, viser en langsommere negativ geotactic respons etter skremme ^2-6. Deres manglende evne til å klatre oppover i et hetteglass apparat så raskt som kontrollforsøk er et tegn på skremme-indusert locomotion defekter.

Effekten av rotenon på lang sikt, er spontan bevegelse ikke godt beskrevet. Drosophila aktivitets skjermer (demninger) har blitt brukt til å overvåke bevegelser i Drosophila døgnrytme studerer ^12,13. Fluer er plassert i individuelle rør, som er lastet opp i dammen. Denne apparatur er utstyrt med en infrarød sensor, som teller antallet ganger en flue bryter den infrarøde strålen. Disse tellinger kan brukes som et mål på uforstyrret bevegelse og aktivitet ^12,13. Ved å plassere fluer i en DAM, kan effekten av rotenon på deres langvarige bevegelse karakteriseres. Denne studien beskriver metoder til måleure kortsiktig skremme-indusert bevegelse og langsiktig spontan bevegelse for å bedre forstå effektene av rotenon mediert motoriske mangler. Karakterisering av locomotion mangler mimicking Parkinsons sykdom er viktige fordi de gir mulighet for studiet av andre forbindelser som kan reversere disse locomotion defekter.

Protocol

1. Drosophila Sjokk-induced Locomotion Assay Drug Treatment Sedate å immobilisere ønsket antall (ca. 8-12) av 1-3 dager gammel mann flyr ved hjelp av CO 2 og transportere dem til hetteglass som inneholder stoffet-supplert mat. Merk: En annen bedøvende f.eks, eter eller is kan bli brukt til å bedøve fluer for å muliggjøre telling og håndtering. Tillat fluer å gjenopprette fra sedasjon i 20 min (eller til gjenvinning) med hetteglasset i en horisontal stil…

Representative Results

Drosophila Sjokk-induced Locomotion Assay Villtype, Canton-S, fluer viste en robust negativ geotactic respons med bare ca 88% og 5% av fluer i topp og bunn seksjoner henholdsvis av dobbel-hetteglass apparat etter 30 sek (figur 1). Fluer utsatt for 125 m og 250 mikrometer rotenon for tre dager viste en svak nedgang i antall fluer i den øverste delen og svak økning i antall fluer i den nederste delen. Fluer utsatt til 500 mikrometer rotenon…

Discussion

I denne studien beskriver vi to prosedyrer for måling både langsiktig spontan bevegelse og kortsiktig skremme-indusert bevegelse i en rotenon-indusert Drosophila modell av Parkinsons sykdom. Man kan også måle disse locomotion egenskaper i fluer utsatt for andre legemidler som er kjent for å modellere Parkinsons sykdom f.eks, Paraquat ^14, genetiske modeller av Parkinsons sykdom f.eks, alfa-synuclein mutanter ^15, og andre flue modeller av sykdommer som påvirker bevege…

Materials

Standard narrow vials	Genesee Scientific	32-120
Rotenone	Sigma	R8875	Store in freezer, make fresh for each experiment
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)	Sigma	D8418	Solvent for rotenone
Instant Drosophila medium	Carolina Biological	Formula 4-24
Drosophila activity monitor (DAM)	Trikinetics	DAM2	trikinetics.com
DAM tubes	Trikinetics	Tubes 5X65 mm
Recipe for Rotenone +food (125 mM dose)			Make 62.5 mM rotenone stock solution in DMSO by dissolving 25 mg rotenone in 1 ml DMSO
			For 125 mM dose, add 10 mM rotenone stock in DMSO to 5 ml water.