Kombine DNA-RNA Floresan<em> In situ</em> Hibridizasyon (FISH) Farklılaştırılmış Kadın Fare Embriyonik Kök Hücreleri X kromozomu inaktivasyonu Eğitim için
Summary
In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücre içinde kendi doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar. Burada fare embriyonik kök hücreleri X kromozomu inaktivasyon incelemek için kullanılabilir FISH vasıtasıyla RNA ve DNA birleşik, eş zamanlı olarak saptanması için bir protokol açıklar.
Abstract
In situ hibridizasyon (FISH) floresan hücrelerdeki nükleik asitlerin saptanmasını sağlayan bir molekül tekniktir. DNA FISH genellikle sitogenetiği ve kanser teşhisinde kullanılan ve çoğu zaman önemli klinik etkileri vardır genomun, sapmaları tespit edebilir. RNA FISH hücrelerde RNA molekülleri tespit etmek için kullanılabilir ve gen ekspresyonunun düzenlenmesinde önemli bilgiler sağlamıştır. DNA FISH için uygun koşullar kırılgan, tek sarmallı RNA molekülleri için çok sert olabilir gibi aynı hücre içinde DNA ve RNA BALIK birleştiren, teknik olarak zordur. Biz burada X kromozomu tarafından kodlanan Xist RNA ve DNA kombine eşzamanlı algılamayı sağlayan kolay uygulanabilir bir protokol mevcut. Bu kombine DNA-RNA FISH protokol muhtemelen RNA ve DNA hem de tespit edilmesi gereken diğer sistemlere de uygulanabilir.
Introduction
In situ hibridizasyon (FISH) floresan vasıtasıyla hücre ve dokuları inceleyerek 1970'lerin 1 yılından bu yana, araştırmacılar subselüler seviyesinde genler, kromatin organizasyonu ve gen ifadesini incelemek için izin vardır. DNA FISH sık sitogenetik, karyotipleme 2, kanser teşhis 3 ve pre-implantasyon genetik tarama 4'te kullanılan ve onların doğal ortamında nükleik asitlerin saptanmasını sağlar çünkü moleküler araştırma 5-6 önemli bir role sahiptir. RNA FISH ile tek hücre ekspresyon analizleri yerli primer transkript algılayabilir ve kodlamayan RNA'lar kromozom transkripsiyonu, ve aralarında örneğin bir nüfus düzeyinde gen ifadesini değerlendirmek diğer tekniklerden avantaj sunuyor kantitatif RT-PCR, genom ekspresyon analizi veya Kuzey lekeleme . Geldikleri sitelerinden doğrudan kaynaklanan RNA transkript görselleştirerek, örneğin olmuşturgen ekspresyon stokastik 7, ve bazen 8 alel spesifik olabilir fark ettim. Tekniğin gelişmeler bile hücreler 9-11 olan bir mRNA moleküllerinin algılama ve ölçümü izin vermektedir.
FISH temel ilkesi, son derece spesifik, Watson ve Crick'in baz eşleştirme aracılığıyla bir nükleik asit sondasına hücre içinde nükleik asitlerin hibridizasyonu oluşur. Sonda, ya doğrudan veya dolaylı olarak tespit edildi, mikroskobik olarak görselleştirilebilen bir sinyal elde olabilir. Başlangıç girişimleri güvenlik sorunları sınırlı uzamsal çözünürlük ve bir süre 12-14 yalnızca bir hedef tespit etme yeteneğine göre sakıncaları vardı radyoaktif olarak etiketlenmiş problar, oluşuyordu. Fluorochromes, haptenlere ve enzimler içeren radyoaktif olmayan etiketler, sonraki gelişme, rutin moleküler biyoloji tekniği olarak FISH yaygın kullanımına izin vermiş. FISH prob ya doğrudan fluoroch ile etiketlenmiş olabilirnükleik asit floresan moleküller ile kimyasal bağlanması romes 15 ve floresanla işaretlenmiş nükleotidlerin 16-19, ya da dolaylı olarak prob (biyotin ve digoksijenin dahil) haptenlerin entegrasyonu ve konjüge edilmiş hapten özgü antikorlarla haptenlerin immünolojik tespiti sonra görselleştirilebilir entegrasyonu dizilerinin flüoresan raportör moleküllerin 20-21. İkinci yaklaşım orijinal sinyal geliştirmek için kullanılan floresan işaretli antikorlar çeşitli katmanları kullanarak sinyal büyütülmesine olanak tanır, ve düşük seviyelerde ifade edilmiştir RNA türünün saptanmasını sağlar. Doğrudan ve dolaylı etiketleme teknikleri ve çeşitli haptenleri birleştirerek, bazı hedefler aynı anda aynı hücre içinde görselleştirilebilir.
FISH protokolleri en önemli adımlardan biri hedefine probun hibridizasyonu. Teorik olarak, bir prob özel uygulamada, hedefine bağlanan tek olsa da, bu özgünlüğüprobları homolog bölgelere bağlanabilir her zaman olduğu gibi, elde edilememesi ve hibridizasyon koşulları daima belirli bir DNA bölgesi ya da RNA türleri için ideal olmayabilir olacaktır. Bunlar FISH prosedürün sıkılığının artırabilir ve arka plan gürültüsü yüksek düzeyde olmasına neden olur FISH prob, spesifik olmayan bağlanmasını önlemek gibi hibridizasyon sonrası yıkamalar, bu nedenle özel bir önem taşımaktadır. RNA molekülleri tek telli gibi kolayca bir BALIK hibritlenmiştir olabilir. Buna karşılık, iki iplikçikli DNA molekülü, birinci bir sonda melezleşebilir sonra denatürasyon adımı gerekmektedir. Bu genellikle DNA'nın denatürasyonu ile sonuçlanan numunenin ısıtılması ile elde edilir. Ancak bu sert koşullar altında, kırılgan, tek sarmallı RNA molekülleri kaybolmuş olabilir. Bu nedenle, birleşik DNA-RNA FISH koşullarının önemli optimizasyon gerektirir ve sadece RNA veya DNA'nın ayrı bir algılama göre daha teknik açıdan zor.
Burada presenta detaylı bizi dişi fare embriyonik kök hücreleri 22-24 ayırt X kromozomu inaktivasyonu (XCI) okuttu kombine, eşzamanlı DNA-RNA FISH protokolü. XCI önemli bir epigenetik dişi embriyonik gelişme için bir mekanizma 25 ve heterochromatinization ile sonuçlanır ve bu nedenle dişi bireyler 26-27 iki X kromozomu birinin susturma. Bu işlem için gerekli 22-23 RNF12 ve REX1 24 proteinler tarafından düzenlenir kodlayıcı olmayan RNA Xist 28-30 vardır. Xist sentezleme embriyonik gelişimi sırasında ya da in vitro ES hücre farklılaşması üzerine gelecek etkin X kromozom (Xi) üzerinde yukarı regüle olur ve X kromozomu boyunca yayılır ve böylece X kromozomu 31 transkripsiyonel kapanmasına neden kromatin yeniden enzimleri de olabilir. Bu Xist RNA yayılan X kromozomal bir kaplama olarak RNA FISH ile görselleştirilebilirbazıları, aynı zamanda bir bulut Xist olarak ifade edilmektedir. Kadın ES hücreleri genomik istikrarsızlık nedeniyle X kromozomu birini kaybedebilir yana, biz ve diğerleri emin sadece karyotipik istikrarlı hücreleri, bu önemli sürecin 22,32 analizinde değerlendirilir emin olmak için, XCI çalışma kombine DNA-RNA FISH istihdam var -34. Her moleküler biyoloji tekniğinde olduğu gibi, çok sayıda farklı mükemmel protokoller 35-38 yayınlanmıştır. Burada izin vermek için, fare ES hücreleri, hücrelerin tespit Nick-çeviri, sabit hücrelerin ön-muamelesi ile FISH prob etiketleme farklılaşmasının indüksiyonu başlayarak eden yöntem mevcut permeabilizasyon ve daha sonra prob alımı, için sondanın hibridizasyon Hedef ve son olarak floresan etiketli antikorlar ile prob tespiti. Burada sunulan protokol Xist RNA sadık algılama ve iki günlük bir süre içinde X kromozomu sağlar ve bu tekniğin temelleri muhtemel ot adapte edilebilirOnun sistemleri ve araştırma alanları.
Protocol
Representative Results
Discussion
DNA FISH için uygun koşullar daha az istikrarlı RNA molekülleri için çok sert olabilir gibi kombine DNA-RNA FISH, teknik olarak zor olabilir. Çeşitli yaklaşımlar hem DNA hem RNA'yı tespit probları ile aynı anda inkübasyon için ihtiyaç engellemeyi, aynı hücre içerisinde DNA ve RNA hem de çalışma uygulanmıştır. Örneğin, bir bindirilmesi yaklaşımda, birinci RNA FISH gerçekleştirilir ve hücre görüntülenmiş ve koordinatlar alınır. Daha sonra, aynı slaytlar RNA FISH sinyalinin kaybol…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank all previous and present members of the department of Reproduction and Development of the Erasmus MC for helpful and stimulating discussions during the past years. We also want to thank the three anonymous reviewers for providing helpful feedback. Work in the Gribnau lab is supported by funding from the Dutch research council (NWO-VICI) and an ERC starting grant.
Materials
| female mouse embryonic stem cells | will be made available upon request | ||
| mouse embryonic fibroblasts | can be derived from E13.5 embryos, or via commercial sources e.g Millipore | ||
| ES cell culture medium | DMEM, 15% foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 0.1 mM ß-mercaptoethanol, and 1000 U ml-1 LIF. Filter sterilize and store at 4ºC for maximal 2 weeks. | ||
| LIF | Chemicon | ESG1107 | |
| DMEM | Invitrogen | 11960085 | |
| Fetal Calf Serum | Invitrogen | 10099141 | |
| Penicillin–streptomycin (100×) | Invitrogen | 15140-122 | |
| Non-essential aminoacids | Invitrogen | 11140-050 | |
| ß-mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M7522 | |
| ES cell differentiation medium | IMDM-Glutamax, 15% heat inactivated foetal calf serum, 100 U ml-1 penicillin, 100 mg ml-1 streptomycin, non-essential amino acids, 37.8 μl/l monothioglycerol and 50 μg/ml ascorbic acid | ||
| IMDM-Glutamax | Invitrogen | 31980-030 | |
| Ascorbic acid (50 mg/ml) | Sigma-Aldrich | A4403 | |
| monothioglycerol | Sigma-Aldrich | M6145 | |
| T25 cell culture dishes | Greiner Bio-one | 690160 | |
| 6-well cell culture dishes | Greiner Bio-one | 662160 | |
| cell culture grade PBS | Sigma-Aldrich | D8537 | |
| Trypsin-EDTA 0.25% (v/v) trypsin/0.2% (w/v) EDTA in PBS | Gibco | 25200-056 | |
| falcon tubes | Falcon | 352196 | |
| 24×24 mm coverslips | Menzle | 780882 | |
| gelatin | Sigma-Aldrich | G1890-100G | prepare a 0.2% gelatin/cell culture PBS solution, and autoclave |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | prepare 4% PFA/PBS solutions, by dissolving PFA in PBS. Stir at 70 ᴼC until completely dissolved and cool down to room temperature. Aliquots can be stored at -20ᴼC |
| absolute 100% ethanol | Sigma-Aldrich | 32221-2.5L | use absolute 100% ethanol and RNAse free water to make 70% and 90% ethanol solutions |
| RNAse free water | Baxter | TKF7114 | |
| sterile filter tips | Rainin Bio Clean | GP-L10F, GP-L200F, RT-1000F | |
| digoxigenin-labeling kit (DIG-Nick translation) | Roche | 11745816910 | |
| biotin-labeling kit (Biotin Nick translation) | Roche | 11745824910 | |
| Sephadex G50 | Sigma-Aldrich | G5080 | |
| 2 ml syringe | BD Plastipak | 300013 | |
| sterilized cotton | |||
| eppendorf tubes | Eppendorf | 30120086 | |
| yeast tRNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15401-029 | |
| Salmon Sperm DNA 10 mg/ml | Invitrogen | 15632-011 | |
| mouse cot-1 DNA 1 mg/ml | Invitrogen | 18440-016 | |
| eppendorf bench top microcentrifuge | Eppendorf | Model 5417R | |
| Eppendorf Refrigerated Centrifuge | Eppendorf | Model 5810R | |
| 2M NaAc, pH 5.6 | Sigma-Aldrich | S7670 | |
| 50+ hybridization solution | 50% formamide, 2x SSC, 50 mM phosphate buffer pH 7, 10% dextran sulfate pH 7 | ||
| formamide | Acros organics | 3272350000 | |
| dextran sulfate | Fluka | 31403 | |
| pepsin | Sigma-Aldrich | P6887 | prepare a 0.2% solution in RNAse free water, and add 84 µl 37% HCL per 100 ml |
| HCL, 37% solution | Fluka | 84422 | |
| object glasses | Starfrost | 8037/1 | |
| 20x SSC | Invitrogen | AM9763 | dilute to 2x SSC in RNAse free water |
| 10 mM Phosphate buffer, pH 7 | add 57.7 ml of 1M Na2HPO4 and 42.3 ml 1M NaH2PO4; use DEPC treated water and autoclave | ||
| denaturation buffer | 70% Formamide/2xSSC/10mM phosphate buffer pH 7 | ||
| Tween-20 | Sigma-Aldrich | P2287 | |
| 2M Tris pH 7.5 solution | |||
| Tris-Saline-Tween washing solution (TST) | 100 ml 10x Saline, 50 ml 2M Tris, 500 µl Tween-20, add RNAse free water till 1 liter | ||
| 10x Saline solution | dissolve 85 g NaCl in 1 liter RNAse free H2O, and autoclave | ||
| Tris-Saline-BSA (TSBSA) | 500 μl 10x Saline, 250 μl 2 M Tris, 1 ml 100x BSA, 3,25 ml RNAse free H2O | ||
| BSA, purified, 100x | New England Biolabs | B9001S | |
| sheep-anti-dig antibody | Roche diagnostics | use 1:500 diluted in TSBSA | |
| rabbit-anti-sheep antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-rabbit antibody conjugated with FITC | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| mouse-anti-biotin antibody | Roche diagnostics | use 1:200 diluted in TSBSA | |
| donkey-anti-mouse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| goat-anti-horse antibody conjugated with Rhodamine | Jackson labs | use 1:250 diluted in TSBSA | |
| Tris-Saline washing solution (TS) | 10 ml 10x Saline, 5 ml 2 M Tris, 85 ml RNAse free H2O | ||
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vectorlabs | H-1200 | |
| nail-varnish | |||
| fluorescent miscroscope |
References
- Rudkin, G. T., Stollar, B. D. High resolution detection of DNA-RNA hybrids in situ by indirect immunofluorescence. Nature. 265, 472-473 (1977).
- Imataka, G., Arisaka, O. Chromosome analysis using spectral karyotyping (SKY). Cell Biochem Biophys. 62, 13-17 (2012).
- Ross, F. M., et al. Report from the European Myeloma Network on interphase FISH in multiple myeloma and related disorders. Haematologica. 97, 1272-1277 (2012).
- Mastenbroek, S., et al. Preimplantation genetic screening: a systematic review and meta-analysis of RCTs. Hum Reprod Update. 17, 454-466 (2011).
- Martins-Taylor, K., Xu, R. H. Concise review: Genomic stability of human induced pluripotent stem cells. Stem Cells. 30, 22-27 (2012).
- Rens, W., et al. Resolution and evolution of the duck-billed platypus karyotype with an X1Y1X2Y2X3Y3X4Y4X5Y5 male sex chromosome constitution. Proc Natl Acad Sci U S A. 101, 16257-16261 (2004).
- Munsky, B., et al. Using gene expression noise to understand gene regulation. Science. 336, 183-187 (2012).
- Miyanari, Y., Torres-Padilla, M. E. Control of ground-state pluripotency by allelic regulation of Nanog. Nature. 483, 470-473 (2012).
- Kwon, S. Single-molecule fluorescence in situ hybridization: quantitative imaging of single RNA molecules. BMB Rep. 46, 65-72 (2013).
- Ji, N., van Oudenaarden, A. Single molecule fluorescent in situ hybridization (smFISH) of C. elegans worms and embryos. WormBook. , 1-16 (2012).
- Femino, A. M., et al. Visualization of single RNA transcripts in situ. Science. 280, 585-590 (1998).
- Buongiorno-Nardelli, M., Amaldi, F. Autoradiographic detection of molecular hybrids between RNA and DNA in tissue sections. Nature. 225, 946-948 (1970).
- Gall, J. G., Pardue, M. L. Formation and detection of RNA-DNA hybrid molecules in cytological preparations. Proc Natl Acad Sci U S A. 63, 378-383 (1969).
- John, H. A., et al. RNA-DNA hybrids at the cytological level. Nature. 223, 582-587 (1969).
- Bauman, J. G., et al. A new method for fluorescence microscopical localization of specific DNA sequences by in situ hybridization of fluorochromelabelled RNA. Exp Cell Res. 128, 485-490 (1980).
- Wiegant, J., et al. In situ hybridization with fluoresceinated DNA. Nucleic Acids Res. 19, 3237-3241 (1991).
- Langer, P. R., et al. Enzymatic synthesis of biotin-labeled polynucleotides: novel nucleic acid affinity probes. Proc Natl Acad Sci U S A. 78, 6633-6637 (1981).
- Manuelidis, L., et al. High-resolution mapping of satellite DNA using biotin-labeled DNA probes. J Cell Biol. 95, 619-625 (1982).
- Kislauskis, E. H., et al. Isoform-specific 3′-untranslated sequences sort alpha-cardiac and beta-cytoplasmic actin messenger RNAs to different cytoplasmic compartments. J Cell Biol. 123, 165-172 (1993).
- Singer, R. H., Ward, D. C. Actin gene expression visualized in chicken muscle tissue culture by using in situ hybridization with a biotinated nucleotide analog. Proc Natl Acad Sci U S A. 79, 7331-7335 (1982).
- Corput, M. P., et al. Fluorescence in situ hybridization using horseradish peroxidase-labeled oligodeoxynucleotides and tyramide signal amplification for sensitive DNA and mRNA detection. Histochem Cell Biol. 110, 431-437 (1998).
- Jonkers, I., et al. RNF12 is an X-Encoded dose-dependent activator of X chromosome inactivation. Cell. 139, 999-101 (2009).
- Barakat, T. S., et al. RNF12 activates Xist and is essential for X chromosome inactivation. PLoS Genet. 7, (2011).
- Gontan, C., et al. RNF12 initiates X-chromosome inactivation by targeting REX1 for degradation. Nature. 485, 386-390 (2012).
- Lyon, M. F. Gene action in the X-chromosome of the mouse (Mus musculus L). Nature. 190, 372-373 (1961).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. X. chromosome inactivation in the cycle of life. Development. 139, 2085-2089 (2012).
- Augui, S., et al. Regulation of X-chromosome inactivation by the X-inactivation centre. Nat Rev Genet. 12, 429-442 (2011).
- Brown, C. J., et al. A gene from the region of the human X inactivation centre is expressed exclusively from the inactive X chromosome. Nature. 349, 38-44 (1991).
- Brockdorff, N., et al. Conservation of position and exclusive expression of mouse Xist from the inactive X chromosome. Nature. 351, 329-331 (1991).
- Borsani, G., et al. Characterization of a murine gene expressed from the inactive X chromosome. Nature. 351, 325-329 (1991).
- Barakat, T. S., Gribnau, J. X chromosome inactivation and embryonic stem cells. Adv Exp Med Biol. 695, 132-154 (2010).
- Chaumeil, J., et al. A novel role for Xist RNA in the formation of a repressive nuclear compartment into which genes are recruited when silenced. Genes Dev. 20, 2223-2237 (2006).
- Okamoto, I., et al. Eutherian mammals use diverse strategies to initiate X-chromosome inactivation during development. Nature. 472, 370-374 (2011).
- Gribnau, J., et al. X chromosome choice occurs independently of asynchronous replication timing. J Cell Biol. 168, 365-373 (2005).
- Namekawa, S. H., Lee, J. T. Detection of nascent RNA, single-copy DNA and protein localization by immunoFISH in mouse germ cells and preimplantation embryos. Nat Protoc. 6, 270-284 (2011).
- Van Tine, B. A., et al. Simultaneous in situ detection of RNA, DNA, and protein using tyramide-coupled immunofluorescence. Methods Mol Biol. 292, 215-230 (2005).
- Pollex, T., et al. Live-Cell Imaging Combined with Immunofluorescence, RNA, or DNA FISH to Study the Nuclear Dynamics and Expression of the X-Inactivation Center. Methods Mol Biol. 1042, 13-31 (2013).
- Chaumeil, J., et al. Combined immunofluorescence, RNA fluorescent in situ hybridization, and DNA fluorescent in situ hybridization to study chromatin changes, transcriptional activity, nuclear organization, and X-chromosome inactivation. Methods Mol Biol. 463, 297-308 (2008).
- Lin, S., Talbot, P. Methods for culturing mouse and human embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 690, 31-56 (2011).
- Meissner, A., et al. Derivation and manipulation of murine embryonic stem cells. Methods Mol Biol. 482, 3-19 (2009).
- Nichols, J., Ying, Q. L. Derivation and propagation of embryonic stem cells in serum- and feeder-free culture. Methods Mol Biol. 329, 91-98 (2006).
