Une méthode de perméabilisation de<em&gt; Drosophila</em&gt; Embryons pour dosages de petites molécules activité

Résumé

Introduction de petites molécules à l'embryon de drosophile en développement offre un grand potentiel pour la caractérisation de l'activité biologique des nouveaux composés, des médicaments et des toxines ainsi que pour sonder les voies fondamentales de développement. Procédés décrits ici donnent un aperçu des mesures qui surmontent les barrières naturelles de cette approche, l'expansion de l'utilité du modèle de l'embryon de drosophile.

Résumé

L'embryon de drosophile a longtemps été un modèle de laboratoire puissant pour élucider les mécanismes moléculaires et génétiques qui contrôlent le développement. La facilité de manipulations génétiques avec ce modèle a supplanté les approches pharmacologiques qui sont monnaie courante dans d'autres modèles animaux et les tests cellulaires. Nous décrivons ici des progrès récents dans un protocole qui permet l'application de petites molécules à la mouche des fruits en développement embryonnaire. La méthode détails des mesures pour surmonter l'imperméabilité de la coquille tout en maintenant la viabilité des embryons. Coquille d'oeuf perméabilisation dans un large éventail de stades de développement est réalisée par application d'un embryon précédemment décrit d-limonène solvant perméabilisation (EPS ¹⁾ et par le vieillissement des embryons à température réduite (18 ° C) avant les traitements. En outre, on utilise un colorant rouge lointain (CY5) en tant qu'indicateur de perméabilisation est décrite, ce qui est compatible avec des applications en aval impliquant grippe rouge et vert standardcolorants orescent dans des préparations en direct et fixes. Ce protocole est applicable à des études utilisant des composés bioactifs pour sonder les mécanismes de développement ainsi que pour des études visant à évaluer l'activité tératogène ou pharmacologique de petites molécules non caractérisés.

Introduction

L'embryon de drosophile continue d'être un modèle de choix pour l'étude des mécanismes fondamentaux du développement ^2. Ce modèle puissant est supporté par un large éventail d'outils génétiques moléculaires qui permettent des manipulations de quasiment n'importe quel gène à n'importe quel point dans le temps et dans le développement de n'importe quel organe. La petite taille, le développement rapide et une caractérisation de la morphogenèse de l'embryon de drosophile en font un modèle de choix pour les écrans génétiques, dont beaucoup ont découvert voies fondamentales de développement ^3,4. De nom....

Protocole

1. Préparation des cultures Fly, Solutions et périphériques embryon de manutention

1. Préparer une culture de la cage de la drosophile. Placez 500 vol + accouplement de la souche souhaitée dans une cage de la population équipée d'une plaque de raisin-agar 10 cm et une tache de pâte de levure. Maintenir la culture dans un incubateur à 25 ° C contrôlée d'humidité. Remarque:   cultures Cage besoin un jour ou deux de conditionnement pour obtenir des motifs de l'embryon pose cohérentes. plaques de raisin avec de la pâte de levure sont changés une fois le matin et une fois le soir au cours du conditionnement.
2. Préparer EP....

Résultats

dispositifs de manipulation de l'embryon sont illustrés à la figure 1 pour aider à visualiser les dispositifs de "home-made" pour la manipulation dans les protocoles ci-dessus. Résultats observés dans la figure 2 illustrent l'effet robuste de l'élevage des embryons à 18 ° C sur leur capacité à être perméabilisées par EPS à des stades tardifs de développement. Cette condition est appliquée dans l'étape de protocole 2.1. L'efficacité de la teinture acide CY5 .......

Discussion

Le procédé ci-dessus décrit un moyen d'obtenir des embryons de drosophile viables qui sont accessibles aux petits soins de molécules dans un large éventail de développement. Cette méthode présente le roman et simple constatation que le vieillissement des embryons à 18 ° C permet la perméabilisation des embryons à un stade avancé avec la même efficacité que vu précédemment que dans les embryons à un stade précoce. En outre, l'utilisation de la CY5 colorant rouge lointain acide carboxylique comme un indic.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Cage à mouches	Flystuff.com	59-101	http://flystuff.com/general.php
Cocamide DEA [Ninol 11-CM]  ;	de commande spéciale	de	Stepan Chemical
Alcool éthoxylé [Bio-soft 1-7]  ;	Stepan Chemical	demande une commande spéciale	http://www.stepan.com/
d-limonène (qualité ultra haute pureté)	Florida Chemical Co.  ;	Appelez pour une commande spéciale	http://www.floridachemical.com/
Hypochlorite de sodium »	Fisher	SS290-4	http://www.fishersci.com/
Tween-20  ;	Fisher	BP337	http://www.fishersci.com/
PBS poudre	Sigma	56064C	http://www.sigmaaldrich.com/
Rhodamine B	Sigma	R6626	http://www.sigmaaldrich.com/
CY5 acide carboxylique	Lumiprobe	#23090	http://www.lumiprobe.com/p/cy5-carboxylic-acid
DMSO	Sigma	472310-100	http://www.sigmaaldrich.com/
Boucliers et Sang M3 medium	Sigma	S8398	http://www.sigmaaldrich.com/
Nitex Nylon mesh  ;	Flystuff.com	57-102	http://flystuff.com/misc.php
Membrane d’oxygène dissous (OD)	YSI	#5793	http://www.ysireagents.com/search.php
25 mm circulaire n° 1 lamelle de protection  ;	VWR	48380-080	https://us.vwr.com/
Mélange de plaques de raisin et de gélose  ;	Flystuff.com	47-102	http://flystuff.com/media.php
Nutator	VWR	82007-202	https://us.vwr.com/

Appel http://www.stepan.com/