Vi præsenterer en high-throughput billede analyse software program til at måle størrelsen af tredimensionale tumor spheroids filmede med lys-felt mikroskopi. Denne applikation giver en hurtig og effektiv måde at undersøge virkningerne af terapeutiske lægemidler på spheroids, hvilket er til gavn for forskere, der ønsker at bruge spheroids i narkotika skærme.
Det stigende antal ansøgninger i tre-dimensionelle (3D) tumor spheroids som en in vitro model for lægemiddelforskning kræver deres tilpasning til store screening formater i alle trin i et lægemiddel skærm, herunder storstilet billedanalyse. I øjeblikket er der ingen klar-til-brug og gratis billede analyse software til at imødekomme denne store format. De fleste eksisterende metoder involverer manuel tegning af længde og bredde af de afbildede 3D spheroids, hvilket er en kedelig og tidskrævende proces. Denne undersøgelse præsenterer en high-throughput billede analyse software applikation – SpheroidSizer, som måler den større og mindre aksial længde af de afbildede 3D tumor spheroids automatisk og præcist; beregner mængden af hver enkelt 3D-tumor klumpformet; derefter udlæser resultaterne i to forskellige former i regneark til nemme manipulationer i den efterfølgende analyse af data. Den største fordel ved denne software er dens magtfulde billedanalyse program, der ertilpasset til et stort antal billeder. Det giver high-throughput beregning og workflow kvalitetskontrol. Den anslåede tid til at behandle 1.000 billeder er omkring 15 min på en minimalt konfigureret laptop, eller omkring 1 min på en multi-core ydeevne arbejdsstation. Den grafiske brugergrænseflade (GUI) er også designet til nem kvalitetskontrol, og brugerne kan manuelt tilsidesætte computer resultater. Nøglen metode i denne software er tilpasset fra den aktive konturalgoritme, også kendt som slanger, som er specielt velegnet til billeder med ujævn belysning og støjende baggrund, der ofte plager automatiseret billeddannelse forarbejdning i high-throughput skærme. Den gratis "Manual Initialize" og "Hånd tegne" værktøjer giver fleksibilitet til at SpheroidSizer i beskæftiger sig med forskellige typer af spheroids og forskellige billeder af høj kvalitet. Denne high-throughput billede analyse software bemærkelsesværdigt reducerer arbejdskraft og fremskynder analyseprocessen. Gennemførelsen af denne software er beneficial til 3D tumor sfæroiderne at blive en rutine in vitro model for narkotika skærme i industrien og den akademiske verden.
Tre-dimensionel (3D) tumor spheroids er "kuglesymmetriske aggregater af tumorceller analoge til væv uden kunstigt substrat for cellebinding" 1-3. Den cytologi og morfologi af tumor sfæroiderne bedre efterligner in vivo tumorvæv organisation og mikromiljøer end monolag todimensionale (2D) celler. 3D tumor spheroids er blevet en praktisk in vitro model for high-throughput screeninger af anti-cancer terapeutiske stoffer eller undersøge effekten af lægemiddelkandidater, før in vivo-dyr eller klinisk afprøvning 4.. Klinisk er effekten af enhver anti-cancer narkotika behandling evalueret baseret på reduceret tumor vækst. Analogt kan spheroid volumen bruges som et mål for effekten af in vitro-undersøgelser kræftbehandlingstargets. Klumpformet volumen (V = 0,5 * Længde * Bredde 2) bestemmes på grundlag af større og mindre aksial længde (mere almindeligt kendt som længde og bredde)af sfæroider 6, 7. De fleste forskere er nødt til manuelt at tegne længde og bredde på hver klumpformet, ofte ved hjælp af software, der tilbydes af mikroskopi virksomheder og sælges sammen med de billeddannende instrumenter. Denne teknik bliver problematisk, når high-throughput narkotika skærme, der udføres og mere end hundredvis af billeder er produceret. Nogle af de seneste undersøgelser rapporterede brug af open source billede analyse software værktøjskasser såsom CellProfiler 8-10 og ImageJ 11 at udvikle rudimentære segmentering rutiner / makroer, som er involveret illumination korrektion og enkel tærskling. Disse rutiner skal ofte være re-korrigeret for forskellige partier af billeder i henhold til belysning tilstand og billedets kontrast forandring; derfor kan disse softwarepakker ikke opfylder robusthed kravet i high-throughput billedanalyse. Friedrich og samarbejdspartnere (2009), der anvendes proprietær software til at måle klumpformet volumen semi-autommatisk 5.. Beskrevet i Monazzam og hans kollegers papir 10 metode var en semi-automatiseret metode til at måle klumpformet størrelse kun for et lille antal billeder. Derfor eksisterer der et klart behov for solide, fleksible, automatiske og klar-til-brug billede analyseværktøjer til 3D-tumor sfæroiderne.
I denne undersøgelse beskriver vi SpheroidSizer – en MATLAB-baserede og open source-software program til at måle størrelsen af tumor spheroids automatisk og præcist. SpheroidSizer er designet til at behandle mange forskellige partier af billeder af 3D spheroids i samme session. Udnytte den aktive konturalgoritme 12-14, kan SpheroidSizer tolerere billedets kontrast forandring, håndfast ignorere gradvis ændring i baggrundsbelysning og genkende spheroids i billedet. Det kan også tåle mange sædvanlige artefakter, fx snavs, stammer fra prøven. Arbejdsgangen er designet, så brugerne kan udføre kvalitet control under eller efter beregning. Manuel overskrivning af analyseresultatet kan let foretages på stedet. Drage fordel af parallel computing værktøjskasse, kan analysen hastigheden yderligere styrket ved at koordinere flere computing kerner at arbejde på beregning samtidigt på en brugers computer. Desuden SpheroidSizer udgange resultaterne i to forskellige former at gøre det let samspil med downstream analyseværktøjer.
Denne undersøgelse præsenterer en hurtig, fleksibel, effektiv og automatiseret program – SpheroidSizer for nøjagtig bestemmelse af størrelsen af 3D-tumor sfæroiderne. SpheroidSizer er nem at bruge og kræver minimal brugerinput. De mest kritiske trin for nøjagtig, glat og vellykket drift af SpheroidSizer omfatter: at sfæroiderne er afbildet i midten af feltet uden at berøre kanten af brønden; alle de filer, der skal analyseres sammen som ét projekt skal afbildes under samme mikroskop med samme formål; alle de filer, der skal analyseres er navngivet og anbragt som vist i protokollen korrekt; og korrekte brugerdefinerede indstillinger er indtastet før beregning.
Fordelene ved SpheroidSizer omfatter dens evne til at tolerere gradvis baggrund ændring i billedet samt at frembringe glatte konturer, der svarer til de almindelige sfæriske former af sfæroider udnytte den aktive konturalgoritme. Ydelse af aktivkontur kan kompromitteres i to situationer: dårlig initialisering, eller tilstedeværelsen af andre lokale kanter distraherende fra den ønskede kontur. Specielt i vores testede tilfælde, den anden situation undertiden ske, når nekrotisk kerne af en stor klumpformet tiltrækker aktive kontur resulterer i mindre kontur blevet indberettet. Det er værd at bemærke, at andre automatiserede tærskel-baserede metoder lider også i denne situation, medmindre tærsklen specifikt er fastsat af hånden. Den software, derfor fremsætter indsats for at hjælpe brugerne med at opdage og afhjælpe kompromitteret segmentering ved at give nem kvalitetskontrol funktioner. Hvis segmentering fejl opstår af dårlig initialisering, kan anvendelser bruge "Manual Initialize" værktøj til at tilsidesætte den automatiske initialisering. Når billedkvaliteten er for dårlig for aktiv kontur, kan brugerne nemt "Hånd Uafgjort" konturen der føres ind kvantificering. Eksisterende software såsom CellProfiler kan tilpasses til denne anvendelse i en halvautomatisk fashion. Arbejdsprocessen kan være besværligt, når store mængder af billeder med forskellige billeddiagnostiske forhold præsenteres, eller når en delmængde af billederne har brug for mere menneskelig indgriben for at måle korrekt. SpheroidSizer giver en alt-i-én pakke til beregning og kvalitetskontrol til at håndtere high-throughput billedanalyse workflow.
SpheroidSizer øjeblikket er begrænset til at opdage én klumpformet pr billede, og kun måler den aksiale længde af klumpformet. Programmet kan udvides til at støtte yderligere kvantificering brug for forskere, såsom kvantificering på spheroids med nekrotisk kerne, afsløre flere spheroids i ét billede eller overvågning af formen af sfæroiderne. Desuden kan programmet modificeres til at detektere og måle størrelsen af de udskårne tumorer fra dyr eller mennesker, som helt sikkert vil være til gavn for forskere, når de foretager in vivo prækliniske eller kliniske forskning. Efterbehandling af de fundne spheroids kan også undersøges målning på at reducere menneskelig indsats er nødvendig for kvalitetskontrol og yderligere forbedre gennemløb. SpheroidSizer er en generaliseret billedanalyse ansøgning til 3D tumor spheroids, der er produceret fra alle celletyper, og derfor kan anvendes af et bredt kræftforskning samfund.
The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke Raymond og Beverly Sackler Foundation for deres støtte på vores forskning.
Axiovert 200M inverted microscope | Carl Zeiss Microscopy, LLC | microscope for imaging | |
Vostro 1720 | Dell Inc. | single-core regular laptop | |
HP Z820 | HP Inc. | multi-core performance workstation | |
Matlab and Simulink R2013a | Mathworks, Inc, Natick, MA | Matlab software |