High-throughput analyse van zoogdieren reukreceptoren: Meting van de Receptor Activering via Luciferaseactiviteit
Summary
Olfactorische receptor activering patronen coderen geur identiteit, maar het gebrek aan gepubliceerde gegevens identificeren geurstof liganden voor zoogdieren reukreceptoren belemmert de ontwikkeling van een alomvattend model van geur codering. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor zeer snelle identificatie van olfactorische receptor liganden en kwantificering van receptoractivering vergemakkelijken.
Abstract
Geurstoffen creëren unieke en overlappende patronen van olfactorische receptor activering, zodat een familie van ongeveer 1.000 muizen en 400 menselijke receptoren tot duizenden geurstoffen herkennen. Odorant liganden verschenen voor minder dan 6% van de humane receptoren 1-11. Dit gebrek aan gegevens is deels te wijten aan moeilijkheden functioneel uiten van deze receptoren in heterologe systemen. Hier beschrijven we een werkwijze voor het uitdrukken van de meerderheid van de olfactorische receptor familie in Hana3A cellen, gevolgd door een hoge-doorvoer beoordeling van olfactorische receptoractivering met een luciferase reporter assay. Deze test kan worden gebruikt om (1) scherm panelen geurstoffen tegen panelen reukreceptoren; (2) bevestigen geurstof / receptor interactie via dosisresponscurven; en (3) vergelijken met receptor activering niveaus onder receptor varianten. In ons voorbeeld, werden 328 reukreceptoren gescreend tegen 26 geurstoffen. Geurstof / receptor paren met verschillende respons scores waren selectieted en getest dosisrespons. Deze gegevens geven aan dat een scherm is een effectieve methode om verrijken geurstof / receptor paren die een dosis respons experiment passen, namelijk receptoren die een bona fide reactie op een geurstof hebben. Daarom is deze hoog-luciferase assay is een effectieve methode om reukreceptoren-een essentiële stap naar een model van geur codering in het zoogdier olfactorische systeem karakteriseren.
Introduction
De zoogdieren olfactorische systeem heeft de mogelijkheid om te reageren op een groot aantal geurende stimuli, waardoor de detectie en discriminatie van duizenden geurstoffen. Reukreceptoren (UPR) zijn de moleculaire sensoren door de olfactorische sensorische neuronen in de olfactorische epitheel 12 uitgedrukt. Zoogdieren geur herkenning gebeurt door verschil in activatie van de UPR door geurstoffen en de OR gen-familie is uitgebreid met zo'n 1.000 muizen en 400 menselijke receptoren 12-16. Vorige functionele analyses van de UPR in olfactorische neuronen en in heterologe cellen hebben aangetoond dat verschillende geurstoffen worden herkend door unieke, maar overlappende ensembles van UPR 10,17-20. Bijpassende liganden voor de UPR is van cruciaal belang voor het begrijpen van de olfactorische code en essentieel voor het opbouwen van levensvatbare modellen van de reukzin. Vanwege problemen uiten UPR in heterologe systemen evenals het grote aantal van zowel geurstoffen en ultraperifere regio's heeft deze gegevens grotendeels afwezig van de f geweestield; inderdaad, minder dan 6% van de menselijke UPR een bekend ligand 1-11. Dit protocol beschrijft het gebruik van een luciferase assay geurstof / of interacties te karakteriseren. Deze test kan de hoge-doorvoer analyse van de UPR, een taak die essentieel is voor het begrijpen van geurstof / of interacties, evenals het ontwikkelen van een model van geur codering.
High-throughput studies van de UPR geconfronteerd drie grote uitdagingen. Eerst UPR expressie in heterologe cellen werden vastgehouden in het ER en vervolgens afgebroken in het proteasoom 21,22, waardoor de UPR interageren met geurstoffen in het testsysteem 23-25. Dit probleem is aangepakt door de ontdekking van accessoire eiwitten die stabiele celoppervlak-expressie van een groot aantal UPR 19,26,27 vergemakkelijken. Receptor-transporter-eiwit 1 en 2 (RTP1 en 2) bevorderen of celoppervlak expressie en activering in respons op stimulatie geurstof 19. Op basis van dit werk, HEK293T cellengemodificeerd om stabiel tot expressie RTP1 lang (RTP1L) en RTP2, receptor-expressieversterkende eiwit 1 en G αolf, waardoor de Hana3A cellijn 19,27. Bovendien, het type 3 muscarine acetylcholine receptor (M3-R) samenwerkt met OR's op het celoppervlak en verbetert activering in reactie op geurstoffen 26. Co-transfectie van een OR met RTP1S en M3-R in Hana3A cellen resulteert in een robuuste, consistente en functionele expressie van een brede waaier van UR op het celoppervlak 27. Ten tweede, zoogdier of repertoires vrij groot. Bij de mens, bijvoorbeeld de OR repertoire is een orde van grootte talrijker dan de smaak receptor repertoire, en 2 ordes van grootte talrijker dan de visuele receptor repertoire. Hoewel het klonen van een OR is een relatief eenvoudig protocol, wordt belangrijke up-front inspanning die nodig is om een uitgebreide bibliotheek te genereren. Ten derde, hoewel we weten dat in de visie, golflengte vertaalt in kleur enin auditie frequentie vertaalt in toonhoogte, wordt de organisatie van geuren slecht begrepen, waardoor het moeilijk voor onderzoekers om interpoleren uit een representatieve steekproef van geurstoffen. Hoewel enige vooruitgang is geboekt op dit front 10,28, de kaart van de olfactorische landschap nog steeds niet voltooid. Screening tienduizenden moleculen tegen honderden UPR is een moeilijke taak; high-throughput-schermen op dit gebied vereisen zorgvuldig gedefinieerd campagnes. De belangrijkste overblijvende uitdagingen die logistiek en kosten dan problemen verbonden wat de techniek. Hoewel heterologe screening is niet op grote schaal gebruikt om liganden te identificeren door academische groepen, is een particuliere onderneming dezelfde techniek gebruikt om liganden te identificeren voor 100 menselijke UPR 29. Helaas, deze gegevens blijven eigendom.
De high-throughput luciferasetest hier geschetst heeft een aantal voordelen ten opzichte van alternatieve methoden die worden gebruikt om te beoordelen of activering. Hoewel de verantwoordelijkheidses van inheemse olfactorische sensorische neuronen zijn gemeten met behulp van elektrofysiologie en calcium beeldvorming, deze technieken hebben moeite plagen elkaar, die of dat leidt tot de reactie van een neuron als gevolg van de overlap in reactie woningen te reukneuronen. Hoewel kloppen in een GFP-gelabeld receptortype 30,31, levert specifieke receptoren via adenovirus reukneuronen muriene 32,33, of het uitvoeren van RT-PCR na opname 17,24,33 kunnen opnamen koppelen aan enkele soorten receptoren zijn deze werkwijzen low-throughput en niet geschikt voor grootschalige schermen. Heterologe screening systemen zijn schaalbaar, en twee belangrijke vormen zijn te vinden in de literatuur: cAMP pathway verslaggevers en inositol trifosfaat (IP3) route verslaggevers. Bij geur stimulatie, UPR activeren G αolf transductie signalerende cascade die leidt tot de productie van cyclisch AMP (cAMP) 12. Door co-transfectie van een vuurvlieg luciferase reportergen onder controle van acAMP respons elementen (CRE), kan luciferase productie worden gemeten als functie van geur respons, waardoor de kwantificering van of activering. OR activering kan ook worden gekoppeld aan de IP3 pad door co-expressie G-eiwitten zoals G α15/16 of G α15-OLF chimeer 24,25,34. We hebben de test hier gepresenteerde gebaseerd op drie factoren gekozen: (1) de co-expressie van RTP1 met Rho-tagged reukreceptoren verbetert de expressie van olfactorische receptoren op het celoppervlak 19,27; (2) gebruik van een cAMP-responsieve reporter gen maakt voor het meten van of activering via canonieke tweede boodschapperpad; en (3) test is zeer geschikt voor high-throughput screens.
Deze high-throughput luciferase assay is voor verschillende studies waardevol voor het gebied van reukzin. Ten eerste kan een groot aantal UPR afgeschermd van een geurstof om de receptoractivering patroon voor een sp bepalenecifieke geurstof. Dit type van studie identificeerde OR7D4 als OR verantwoordelijk voor het reageren op de steroïde geurstof androstenon 8. Omgekeerd kan een of afgeschermd van een panel van geurstoffen teneinde de receptor responsprofiel 10 bepalen. Als kandidaat olfactorische reukstof / OF paren geïdentificeerd via deze schermen kan de interactie worden bevestigd door het uitvoeren van een dosis-respons-experiment onderzoekt de respons van de OF toenemende concentraties van geurstof. Dosisresponscurven kan ook beoordelen hoe genetische variatie in een OR invloed in vitro geurstof reactie 8,9,11,35, en deze studies kan worden uitgebreid tot interspecifieke OF variatie, waardoor het onderzoek van receptor evolutie tussen soorten en causale mutaties in de evolutie 36,37, tenslotte deze test kan worden gebruikt om te screenen op antagonisten die geur kunnen tegenwerken of reactie op een bepaalde geurstof voor een bekende geurstof / receptor paar 38,39 zijn. Samengevat, deze hogeThroughput luciferase assay is toepasbaar op een reeks studies die zullen helpen karakteriseren of activeringspatronen en een beter begrip van geur codering in het olfactorische systeem.
Protocol
Representative Results
Discussion
Geurstof identiteit wordt gecodeerd door reukreceptor activeringspatronen, maar receptoractivering patronen, waaronder die receptoren geactiveerd en in welke mate, zijn bekend om minder dan 6% van de menselijke olfactorische receptoren 1-11. Pogingen om reukreceptoren karakteriseren zijn beperkt door hun arbeidsintensief en toepasbaarheid slechts een subset van de olfactorische receptorfamilie 17,23,24,33,34. De Hana3A heterologe expressie ondersteunt de robuuste expressie van de meeste geteste reu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door R01 DC013339, R03 DC011373, en Ruth L. Kirschstein National Research Service Award T32 DC000014. Een deel van het werk werd uitgevoerd met het Monell chemosensory receptor signalering Core, die wordt ondersteund, voor een deel, door financiering van de NIH-NIDCD Core Grant P30 DC011735. De auteurs danken C. Sezille voor hulp bij het verzamelen van gegevens.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, a. D., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
