ניתוח תפוקה גבוהה של קולטני ריח יונקים: מדידה של קולטן הפעלה באמצעות בלוציפראז פעילות
Summary
דפוסי הפעלה קולטני ריח לקודד זהות ריח, אך המחסור בנתונים שפורסמו זיהוי ligands odorant לקולטני ריח של יונקים מעכב את ההתפתחות של מודל מקיף של קידוד ריח. פרוטוקול זה מתאר שיטה לזיהוי לתפוקה גבוהה של ligands קולטני ריח וכימות של הפעלת קולט.
Abstract
ניחוחות ליצור דפוסים ייחודיים וחופפים של הפעלה קולטני ריח, המאפשרים למשפחה של כ -1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים להכיר אלפי ניחוחי. ligands odorant פורסמו על פחות מ -6% של קולטנים אנושיים 1-11. זה חוסר הנתונים נובע בחלקו לקשיים תפקודי המבטאים קולטנים אלה במערכות Heterologous. כאן, אנו מתארים שיטה לביטוי המכריע של משפחת חוש הריח קולטן בתאי Hana3A, ואחריו הערכת תפוקה גבוהה של הפעלה קולטני ריח באמצעות assay כתב בלוציפראז. assay זה יכול לשמש כדי (1) פנלי מסך של ניחוחי נגד פנלים של קולטני ריח; (2) לאשר אינטראקציה odorant / קולט באמצעות עקומות מינון תגובה; ו (3) להשוות את רמות הפעלת קולטן בין גרסאות הקולטן. בנתוני הדוגמא שלנו, 328 קולטני ריח הוקרנו נגד 26 הניחוח. זוגות odorant / קולטן עם ציוני תגובה שונים היו אין תמיכה בבחירהטד ונבדק בתגובה מינון. נתונים אלה מצביעים על כך שמסך הוא שיטה יעילה להעשרה לזוגות odorant / קולט שיעברו ניסוי תגובת מינון, כלומר הקולטנים שיש לי תגובה בתום לב לodorant. לכן, assay לוציפראז תפוקה גבוהה זו הוא שיטה יעילה לאפיון קולטנים צעד חיוני חוש הריח לכיוון מודל של קידוד ריח במערכת ההרחה של היונקים.
Introduction
מערכת חוש הריח של היונקים יש את היכולת להגיב למספר עצום של גירויים ריחניים, המאפשרים זיהוי ואפליה של אלפי ניחוחי. קולטני ריח (אס) הם החיישנים המולקולריים שהביעו עצב סנסורי חוש הריח באפיתל ההרחה 12. הכרת ריח יונקים מתרחשת באמצעות הפעלת ההפרש של חדרי ניתוח על ידי ניחוחי, ו-OR משפחת הגן היא נרחבת, עם בערך 1,000 עכברי ו400 קולטנים אנושיים 12-16. הניתוחים תפקודיים קודמים של חדרי ניתוח בתאי עצב של חוש ריח ובתאי Heterologous הראו כי ניחוחי שונה מוכרים על ידי ייחודי, אבל חופף הרכבים של חדרי ניתוח 10,17-20. התאמת ligands לחדרי ניתוח היא קריטית להבנת הקוד וחיוני לבניית מודלים מעשי של חוש ריח חוש הריח. בשל קשיים להביע חדרי ניתוח במערכות Heterologous, כמו גם מספר רב של שניהם ניחוחי וחדרי ניתוח, הנתונים אלה נעדרו במידה רבה מfield; אכן, פחות מ -6% מחדרי ניתוח באדם יש ליגנד פורסם 1-11. פרוטוקול זה מתאר את השימוש של assay לוציפראז לאפיין odorant / או אינטראקציות. assay זה מאפשר אפיון התפוקה גבוהה של או.אר. אס, משימה שהיא חיוני להבנת odorant / או אינטראקציות כמו גם בפיתוח מודל של קידוד ריח.
מחקרי תפוקה גבוהה של חדרי ניתוח בפני שלושה אתגרים מרכזיים. ראשית, או.אר. האס באו לידי ביטוי בתאי Heterologous נשמרו בחדר המיון ומושפל לאחר מכן בהפרוטאזום 21,22, מניעת חדרי הניתוח מאינטראקציה עם ניחוחי במערכת assay 23-25. בעיה זו טופלה על ידי הגילוי של חלבוני אבזר המאפשרים ביטוי על פני קרום התא יציב של מגוון רחב של חדרי הניתוח 19,26,27. קולטן חלבוני טרנספורטר-1 ו -2 (RTP1 ו2) לקדם או ביטוי על פני קרום תא והפעלה בתגובה לגירוי odorant 19. המבוסס על עבודה זו, תאי HEK293T היושונה כדי להביע את היציבות RTP1 ארוך (RTP1L) וRTP2, חלבון שיפור ביטוי הקולטן 1, וαolf G, וכתוצאה משורת תאי Hana3A 19,27. בנוסף, קולטן מסוג 3 מוסקריניים אצטילכולין (M3-R) אינטראקציה עם חדרי ניתוח על פני התא ומשפר הפעלה בתגובה לניחוחי 26. Co-transfection של OR עם RTP1S וM3-R לתוצאות תאי Hana3A בביטוי חזק, עקבי ופונקציונלי של מגוון רחב של חדרי ניתוח על פני תא 27. שנית, יונקים או רפרטוארים הם גדולים למדי. בבני אדם, למשל, רפרטואר OR הוא סדר גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט התעורר אצלם, ו -2 סדרי גודל רב יותר מאשר רפרטואר קולט החזותי. למרות שיבוט בודד או הוא פרוטוקול פשוט יחסית, נדרש מאמץ מעלה מול משמעותי כדי ליצור ספרייה מקיפה. שלישית, למרות שאנו יודעים כי בראייה, אורך גל מתורגם לצבע ובתדירות אודישן מיתרגם המגרש, והארגון של ריחות הוא הבין היטב, מה שהקשה על חוקרים ללשרבב ממדגם מייצג של ניחוחי. למרות שחלק מהתקדמות שנעשתה ב10,28 חזית זו, המפה של נוף חוש הריח נשארת שלמה. הקרנת עשרות אלפי מולקולות נגד מאות חדרים הניתוח היא משימה מרתיעה; מסכי תפוקה גבוהה בתחום זה דורשים קמפיינים שהוגדרו בזהירות. האתגרים הנותרים העיקריים הם אלה של לוגיסטיקה ועלות ולא בעיות הטמונות לטכניקה. למרות הקרנת Heterologous לא הייתה בשימוש נרחב כדי לזהות ligands ידי קבוצות אקדמיות, חברה פרטית שהשתמשה באותה הטכניקה כדי לזהות ligands ל100 חדרי ניתוח אנושיים 29. למרבה הצער, הנתונים האלה יישארו קניינית.
יש assay לוציפראז התפוקה גבוהה המתוארים כאן מספר יתרונות על פני שיטות חלופיות המשמשות להערכה או הפעלה. למרות responses של עצב סנסורי חוש הריח האם נמדד באמצעות אלקטרופיזיולוגיה והדמיה סידן, יש טכניקות אלה מתקשים מתגרים מזה בו או גורם לתגובה של נוירון בשל החפיפה במאפייני תגובה לנוירונים חוש הריח. למרות דפיקות-בסוג הקולטן-GFP שכותרת 30,31, אספקת קולטנים ספציפיים באמצעות adenovirus לMurine נוירונים חוש הריח 32,33, או ביצוע RT-PCR אחרי הקלטות 17,24,33 יכולים לקשר הקלטות לסוגים בודדים קולט, שיטות אלו נמוכה תפוקה ואינה מתאים למסכים בקנה מידה גדולה. מערכות הקרנת Heterologous הן מדרגי יותר, ושתי צורות עיקריות נמצאות בספרות: כתבי מסלול cAMP ואדנוזין אינוזיטול כתבי מסלול (IP3). על גירוי ריח, או.אר. אס להפעיל מפל איתות התמרה αolf G כי תוצאות בייצור של AMP המחזורי (cAMP) 12. על ידי שיתוף transfecting גן כתב גחלילית בלוציפראז תחת שליטתו של acאלמנט התגובה AMP (CRE), ייצור לוציפראז ניתן למדוד כפונקציה של תגובת ריח, המאפשר כימות של או הפעלה. או הפעלה יכולה גם להיות קשורה למסלול IP3 על ידי שיתוף להביע G-חלבונים כגון G α15/16 או 24,25,34 הכימרה α15-OLF G. אנו בחרנו בassay המוצג כאן מבוסס על שלושה גורמים: (1) שיתוף הביטוי של RTP1 עם קולטני ריח מתויג-Rho משפר את הביטוי של קולטני ריח בתא השטח 19,27; (2) שימוש בגן כתב cAMP מגיב מאפשר למדידה או ההפעלה דרך מסלול השליח השני הקנונית; ו (3) assay הוא מתאים היטב למסכי תפוקה גבוהה.
assay לוציפראז תפוקה גבוהה זה חל על מגוון רחב של מחקרים חשובים בתחום לחוש ריח. ראשית, מספר גדול של חדרי ניתוח יכול להיות מוקרן נגד odorant בודד על מנת לקבוע את דפוס הפעלת קולטן עבור spodorant ecific. סוג זה של מחקר זיהה OR7D4 כאו אחראי למתן מענה לandrostenone odorant סטרואידי 8. לעומת זאת, אחד או יכול להיות מוקרן נגד פנל של ניחוחי על מנת לקבוע את פרופיל תגובת קולט 10. כאשר odorant מועמד חוש הריח / או זוגות מזוהים באמצעות מסכי אלה, אינטראקציה יכולה להיות מאושרת על ידי ביצוע ניסוי תגובת מינון בוחן את התגובה של או לריכוזים הולך וגדל של odorant. עקומות מינון תגובה יכולות גם להעריך כיצד שונות גנטיות באו משפיעה בתגובה odorant מבחנה 8,9,11,35, וניתן להרחיב את הלימודים האלה לinterspecific או וריאציה, המאפשרים הבדיקה של אבולוציה קולטן על פני מינים ומוטציות סיבתי באבולוציה 36,37, לבסוף, assay זה יכול לשמש מסך ליריבי ריח כי הם מסוגלים להרגיז או תגובה לodorant במיוחד עבור זוג odorant / קולט ידוע 38,39. לסיכום, זה גבוהassay לוציפראז התפוקה הוא ישים למגוון רחב של מחקרים שיעזרו לאפיין או דפוסי הפעלה ולספק הבנה טובה יותר של קידוד ריח במערכת חוש הריח.
Protocol
Representative Results
Discussion
זהות odorant מקודדת על ידי דפוסי הפעלה קולטני ריח, אבל דפוסי הפעלת קולטן, כולל שהקולטנים מופעלים ובאיזו מידה, ידועים פחות מ -6% מקולטניים ריח האנושי 1-11. מאמצים לאפיין קולטני ריח היו מוגבלים על ידי השיטות עתירות העבודה או תחולתם רק קבוצת משנה של 17,23,24,33,34 משפחה קו…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
עבודה זו נתמכה על ידי R01 DC013339, R03 DC011373, ורות ל 'Kirschstein השירות הלאומי לחקר פרס T32 DC000014. חלק מהעבודה בוצע באמצעות Monell chemosensory קולטן איתות הליבה, אשר נתמכה בחלקו על ידי מימון מDC011735 P30-NIH NIDCD Core גרנט. המחברים מודים ג Sezille לעזרה באיסוף הנתונים.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
References
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (1999).
- Spehr, M., et al. Identification of a testicular odorant receptor mediating human sperm chemotaxis. Science. 299 (5615), 2054-2058 (2003).
- Sanz, G., Schlegel, C., Pernollet, J. -. C., Briand, L. Comparison of odorant specificity of two human olfactory receptors from different phylogenetic classes and evidence for antagonism. Chemical senses. 30 (1), 69-80 (2005).
- Matarazzo, V., et al. Functional characterization of two human olfactory receptors expressed in the baculovirus Sf9 insect cell system. Chemical senses. 30 (3), 195-207 (2005).
- Jacquier, V., Pick, H., Vogel, H. Characterization of an extended receptive ligand repertoire of the human olfactory receptor OR17-40 comprising structurally related compounds. Journal of neurochemistry. 97 (2), 537-544 (2006).
- Neuhaus, E. M., Mashukova, A., Zhang, W., Barbour, J., Hatt, H. A specific heat shock protein enhances the expression of mammalian olfactory receptor proteins. Chemical senses. 31 (5), 445-452 (2006).
- Shirokova, E., et al. Identification of specific ligands for orphan olfactory receptors. G protein-dependent agonism and antagonism of odorants. The Journal of biological chemistry. 280 (12), 11807-11815 (2005).
- Keller, A., Zhuang, H., Chi, Q., Vosshall, L. B., Matsunami, H. Genetic variation in a human odorant receptor alters odour perception. Nature. 449 (7161), 468-472 (2007).
- Menashe, I., et al. Genetic elucidation of human hyperosmia to isovaleric acid. PLoS biology. 5 (11), (2007).
- Saito, H., Chi, Q., Zhuang, H., Matsunami, H., Mainland, J. D. Odor coding by a Mammalian receptor repertoire. Science signaling. 2 (60), (2009).
- Jaeger, S. R., et al. A Mendelian Trait for Olfactory Sensitivity Affects Odor Experience and Food Selection. Current Biology. 23, 1-5 (2013).
- DeMaria, S., Ngai, J. The cell biology of smell. The Journal of cell biology. 191 (3), 443-452 (2010).
- Zhang, X., Firestein, S. The olfactory receptor gene superfamily of the mouse. Nature nauroscience. 5 (2), 124-1233 (2002).
- Glusman, G., Yanai, I., Rubin, I., Lancet, D. The complete human olfactory subgenome. Genome research. 11 (5), 685-702 (2001).
- Olender, T., Lancet, D., Nebert, D. W. Update on the olfactory receptor (OR) gene superfamily. Human Genomics. 3 (1), 87 (2008).
- Mombaerts, P. Genes and ligands for odorant, vomeronasal and taste receptors. Nature reviews. Neuroscience. 5 (4), 263-278 (2004).
- Malnic, B., Hirono, J., Sato, T., Buck, L. B. Combinatorial receptor codes for odors. Cell. 96 (5), 713-723 (1999).
- Araneda, R. C., Kini, a. D., Firestein, S. The molecular receptive range of an odorant receptor. Nature. 3 (12), 1248-1255 (2000).
- Saito, H., Kubota, M., Roberts, R. W., Chi, Q., Matsunami, H. RTP family members induce functional expression of mammalian odorant receptors. Cell. 119 (5), 679-691 (2004).
- Katada, S., Hirokawa, T., Oka, Y., Suwa, M., Touhara, K. Structural basis for a broad but selective ligand spectrum of a mouse olfactory receptor: mapping the odorant-binding site. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 25 (7), 1806-1815 (2005).
- Lu, M., Echeverri, F., Moyer, B. D. Endoplasmic Reticulum Retention, Degradation, and Aggregation of Olfactory G-Protein Coupled Receptors. Traffic. 4 (6), 416-433 (2003).
- McClintock, T. S., et al. Functional expression of olfactory-adrenergic receptor chimeras and intracellular retention of heterologously expressed olfactory receptors. Brain research. Molecular brain research. 48 (2), 270-278 (1997).
- Zhao, H. Functional Expression of a Mammalian Odorant Receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Kajiya, K., Inaki, K., Tanaka, M., Haga, T., Kataoka, H., Touhara, K. Molecular bases of odor discrimination: Reconstitution of olfactory receptors that recognize overlapping sets of odorants. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 21 (16), 6018-6025 (2001).
- Krautwurst, D., Yau, K., Reed, R. R., Hughes, H. Identification of Ligands for Olfactory Receptors. Cell. 95, 917-926 (1998).
- Li, Y. R., Matsunami, H. Activation state of the M3 muscarinic acetylcholine receptor modulates mammalian odorant receptor signaling. Science signaling. 4 (155), (2011).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Evaluating cell-surface expression and measuring activation of mammalian odorant receptors in heterologous cells. Nature. 3 (9), 1402-1413 (2008).
- Haddad, R., Khan, R., Takahashi, Y. K., Mori, K., Harel, D., Sobel, N. A metric for odorant comparison. Nature methods. 5 (5), 425-429 (2008).
- Veithen, A., Wilkin, F., Philippeau, M., Van Osselaer, C., Chatelain, P. Olfactory Receptors: From basic science to applications in flavors and fragrances. Perfumer and Flavorist. 35 (1), 38-40 (2010).
- Bozza, T., Feinstein, P., Zheng, C., Mombaerts, P. Odorant receptor expression defines functional units in the mouse olfactory system. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 22 (8), 3033-3043 (2002).
- Oka, Y., Katada, S., Omura, M., Suwa, M., Yoshihara, Y., Touhara, K. Odorant receptor map in the mouse olfactory bulb: in vivo sensitivity and specificity of receptor-defined glomeruli. Neuron. 52 (5), 857-869 (2006).
- Zhao, H., Ivic, L., Otaki, J. M., Hashimoto, M., Mikoshiba, K., Firestein, S. Functional expression of a mammalian odorant receptor. Science. 279 (5348), 237-242 (1998).
- Touhara, K., et al. Functional identification and reconstitution of an odorant receptor in single olfactory neurons. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 96 (7), 4040-4045 (1999).
- Zhuang, H., Matsunami, H. Synergism of accessory factors in functional expression of mammalian odorant receptors. The Journal of biological chemistry. 282 (20), 15284-15293 (2007).
- McRae, J. F., Mainland, J. D., Jaeger, S. R., Adipietro, K. A., Matsunami, H., Newcomb, R. D. Genetic variation in the odorant receptor OR2J3 is associated with the ability to detect the "grassy" smelling odor, cis-3-hexen-1-ol. Chemical senses. 37 (7), 585-593 (2012).
- Adipietro, K. A., Mainland, J. D., Matsunami, H. Functional evolution of mammalian odorant receptors. PLoS genetics. 8 (7), (2012).
- Zhuang, H., Chien, M. -. S., Matsunami, H. Dynamic functional evolution of an odorant receptor for sex-steroid-derived odors in primates. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (50), 21247-21251 (2009).
- Oka, Y., Nakamura, A., Watanabe, H., Touhara, K. An odorant derivative as an antagonist for an olfactory receptor. Chemical senses. 29 (9), 815-822 (2004).
- Oka, Y., Omura, M., Kataoka, H., Touhara, K. Olfactory receptor antagonism between odorants. The EMBO journal. 23 (1), 120-126 (2004).
- Fawcett, T. An introduction to ROC analysis. Pattern Recognition Letters. 27 (8), 861-874 (2006).
- Baghaei, K. A. Olfactory Receptors. Olfactory Recept. Methods Protoc. 1003, 229-238 (2013).
- Dey, S., Zhan, S., Matsunami, H. Assaying surface expression of chemosensory receptors in heterologous cells. Journal of visualized experiments JoVE. (48), (2011).
