High-throughput Analisi dei mammiferi olfattive Recettori: Misurazione del recettore Attivazione tramite Luciferase Activity
Summary
Olfattive pattern di attivazione del recettore codificano identità odore, ma la mancanza di dati pubblicati identificativi ligandi odoranti per i recettori olfattivi dei mammiferi ostacola lo sviluppo di un modello completo di codifica odore. Questo protocollo descrive un metodo per facilitare l'identificazione ad alta produttività di ligandi dei recettori olfattivi e quantificazione di attivazione del recettore.
Abstract
Odoranti di creare modelli unici e sovrapposte di attivazione del recettore olfattivo, permettendo una famiglia di circa 1.000 murino e 400 recettori umani di riconoscere migliaia di odoranti. Ligandi odoranti sono stati pubblicati da meno di 6% di recettori umani 1-11. Questa mancanza di dati è dovuta in parte alle difficoltà funzionalmente esprimono questi recettori in sistemi eterologhi. Qui, descriviamo un metodo per esprimere la maggior parte della famiglia dei recettori olfattiva in cellule Hana3A, seguita da valutazione ad alta velocità di attivazione del recettore olfattivo utilizzando un saggio reporter di luciferasi. Questo test può essere utilizzato per (1) pannelli schermo di odoranti contro pannelli di recettori olfattivi; (2) confermare l'interazione odorizzante / recettore tramite curve dose-risposta; e (3) confrontare i livelli di attivazione del recettore tra le varianti del recettore. Nei nostri dati di esempio, 328 recettori olfattivi sono stati proiettati contro 26 odoranti. Coppie di odorizzante / recettori con diversi punteggi di risposta erano selezioneted e testato in dose-risposta. Questi dati indicano che uno schermo è un metodo efficace per arricchire per coppie odorizzante / recettore che passeranno un esperimento dose-risposta, cioè recettori che hanno una risposta bona fide a un odorizzante. Pertanto, questa high throughput saggio luciferasi è un metodo efficace per caratterizzare olfattiva recettori-un passo essenziale verso un modello di codifica odore nel sistema olfattivo dei mammiferi.
Introduction
Il sistema olfattivo dei mammiferi ha la capacità di rispondere ad un vasto numero di stimoli odorosi, consentendo la rilevazione e la discriminazione di migliaia di odoranti. Recettori olfattivi (OR) sono i sensori molecolari espressi dai neuroni sensoriali olfattivi nell'epitelio olfattivo 12. Riconoscimento odore dei mammiferi avviene attraverso l'attivazione differenziale delle RUP di odoranti, e l'OR famiglia di geni è ampia, con circa 1.000 murino e 400 recettori umani 12-16. Analisi funzionali precedenti di RUP nei neuroni olfattivi e nelle cellule eterologhe hanno dimostrato che diversi odoranti sono riconosciuti da unico, ma insiemi di RUP 10,17-20 sovrapposizione. Corrispondenza ligandi di RUP è fondamentale per comprendere il codice olfattivo ed essenziale per la costruzione di modelli sostenibili di olfatto. A causa delle difficoltà che esprimono RUP in sistemi eterologhi nonché il gran numero di entrambi odoranti e RUP, questi dati è stato praticamente assente dal field; anzi, meno del 6% delle RUP umani hanno un ligando pubblicato 1-11. Questo protocollo descrive l'uso di un saggio di luciferasi per caratterizzare odoranti / o interazioni. Questo test consente la caratterizzazione high-throughput di RUP, un compito che è essenziale per comprendere odorizzante / o interazioni, nonché lo sviluppo di un modello di codifica odore.
Gli studi High-throughput di RUP devono affrontare tre grandi sfide. In primo luogo, OR espressi in cellule eterologhe sono stati mantenuti al pronto soccorso e successivamente degradata nel proteasoma 21,22, impedendo ai RUP di interagire con odoranti nel sistema di dosaggio 23-25. Questo problema è stato affrontato dalla scoperta di proteine accessorie che facilitano l'espressione sulla superficie cellulare stabile di una vasta gamma di RUP 19,26,27. Receptor-trasportatore-proteine 1 e 2 (RTP1 e 2) promuovere o espressione sulla superficie cellulare e l'attivazione in risposta alla stimolazione odorizzante 19. Sulla base di questo lavoro, HEK293T cellule eranomodificata per esprimere stabilmente RTP1 lungo (RTP1L) e RTP2, recettore espressione di miglioramento proteina 1, e G αolf, risultante nella linea cellulare Hana3A 19,27. Inoltre, il tipo 3 recettori muscarinici (M3-R) interagisce con RUP sulla superficie cellulare e migliora l'attivazione in risposta a odoranti 26. Co-trasfezione di un OR con RTP1S e M3-R in Hana3A cellule risultati nella robusta, coerente e funzionale espressione di una vasta gamma di RUP sulla superficie cellulare 27. In secondo luogo, mammifero o repertori sono abbastanza grandi. Negli esseri umani, per esempio, il repertorio OR è un ordine di grandezza più numerose di repertorio recettore gustativo, e 2 ordini di grandezza più numerose di repertorio recettore visivo. Sebbene clonazione di una singola O è un protocollo relativamente semplice, è necessaria notevole sforzo up-front per generare una libreria completa. In terzo luogo, anche se sappiamo che nella visione, di lunghezza d'onda si traduce in colori ein frequenza audizione si traduce in campo, l'organizzazione degli odori è poco conosciuta, rendendo difficile per i ricercatori di interpolare da un campione rappresentativo di odoranti. Anche se sono stati compiuti alcuni progressi su questo fronte 10,28, la mappa del paesaggio olfattivo rimane incompleto. Screening decine di migliaia di molecole contro centinaia di RUP è un compito arduo; schermi high-throughput in questo settore richiedono campagne accuratamente definiti. Le grandi sfide rimanenti sono quelli della logistica e dei costi, piuttosto che problemi inerenti alla tecnica. Sebbene lo screening eterologo non è stato ampiamente utilizzato per identificare ligandi da gruppi accademici, una società privata ha utilizzato la stessa tecnica per identificare ligandi per 100 RUP umani 29. Purtroppo, questi dati rimangono di proprietà.
La luciferasi saggio ad alta prestazione qui descritto ha diversi vantaggi rispetto ai metodi alternativi utilizzati per valutare O attivazione. Anche se la responsabilitàses dei neuroni sensoriali olfattivi nativi sono stati misurati utilizzando elettrofisiologia e di imaging di calcio, queste tecniche hanno difficoltà a prendere in giro oltre che O porta alla risposta di un neurone causa della sovrapposizione di proprietà di risposta per i neuroni olfattivi. Anche se bussare in una GFP-etichettata tipo di recettore 30,31, offrendo recettori specifici tramite adenovirus murino neuroni olfattivi 32,33, o l'esecuzione di RT-PCR dopo le registrazioni 17,24,33 può collegarsi registrazioni tipi di recettori singoli, questi metodi sono a bassa velocità e non adatto per schermi di grandi dimensioni. Sistemi di screening eterologhi sono più scalabili, e due forme principali si trovano in letteratura: i giornalisti di via cAMP e inositolo trifosfato (IP3) giornalisti di via. Dopo stimolazione odore, RUP attivano una cascata di segnali G αolf trasduzione che provoca la produzione di AMP ciclico (cAMP) 12. Mediante co-trasfezione una lucciola gene reporter luciferasi sotto il controllo di acAMP risposta elemento (CRE), produzione luciferasi può essere misurata in funzione della risposta odore, permettendo la quantificazione di OR attivazione. O attivazione può anche essere collegata al percorso IP3 mediante co-esprimono proteine G come G α15/16 o un G α15-OLF chimera 24,25,34. Abbiamo scelto il saggio qui presentato sulla base di tre fattori: (1) la co-espressione di RTP1 con i recettori olfattivi Rho-contrassegnate migliora l'espressione di recettori olfattivi sulla superficie cellulare 19,27; (2) l'uso di un gene reporter cAMP-reattivo consente la misurazione di OR attivazione attraverso il percorso del secondo messaggero canonica; e (3) il saggio è adatto agli schermi high-throughput.
Questo saggio luciferasi ad alta produttività è applicabile ad una varietà di pregevoli studi al campo dell'olfatto. In primo luogo, un gran numero di RUP può essere proiettato contro un singolo odorante per determinare lo schema di attivazione recettore di un spodorizzante ecific. Questo tipo di studio ha identificato OR7D4 come OR responsabile per rispondere alla steroide androstenone odorizzante 8. Viceversa, uno o potrà essere schermato contro un pannello di odoranti per determinare il profilo di risposta recettore 10. Quando candidato olfattivo odorizzante / O coppie sono identificati tramite questi schermi, interazione può essere confermata effettuando un esperimento dose risposta esaminando la risposta del OR a concentrazioni crescenti di odorizzante. Curve dose-risposta possono anche valutare come variazione genetica in un OR colpisce in vitro risposta odorizzante 8,9,11,35, e questi studi possono essere esteso a interspecifica o variazione, consentendo l'esame dell'evoluzione del recettore attraverso le specie e le mutazioni causali nell'evoluzione 36,37, infine, questo saggio può essere utilizzato per lo screening di antagonisti odori che sono in grado di antagonizzare o la risposta ad una particolare odorizzante per una coppia odorizzante / ricevitore conosciuto 38,39. In sintesi, questo alto-Capacità saggio luciferasi è applicabile ad una serie di studi che aiuteranno caratterizzano o pattern di attivazione e fornire una migliore comprensione della codifica odore nel sistema olfattivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identità odorizzante è codificato da olfattivi pattern di attivazione del recettore, ma pattern di attivazione del recettore, tra cui i recettori che vengono attivati e in che misura, sono noti da meno di 6% dei recettori olfattivi umani 1-11. Gli sforzi per caratterizzare i recettori olfattivi sono stati limitati dai loro metodi o applicabilità alta intensità di lavoro solo a un sottoinsieme della olfattivo 17,23,24,33,34 famiglia di recettori. Il sistema di espressione eterologo Hana3A …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto da DC013339 R01, R03 DC011373, e Ruth L. Kirschstein Servizio National Research Award T32 DC000014. Una parte del lavoro è stato eseguito utilizzando il Monell chemosensory Receptor segnalazione core, che è supportato, in parte, da un finanziamento della P30 DC011735 NIH-NIDCD core Grant. Gli autori ringraziano C. Sezille aiuto con la raccolta dei dati.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
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