De alta capacidade de análise de mamíferos olfativas Receptores: Medição do Receptor de ativação via luciferase Atividade
Summary
Padrões de ativação de receptores olfativos codificar identidade odor, mas a falta de dados publicados que identificam ligantes olfativos para receptores olfativos mamíferos impede o desenvolvimento de um modelo abrangente de codificação odor. Este protocolo descreve um método para facilitar a identificação de alto rendimento de ligandos de receptores olfactivos e quantificação da activação do receptor.
Abstract
Fragrâncias criar padrões únicos e sobrepostos de ativação do receptor olfativo, permitindo que uma família de aproximadamente 1.000 murino e 400 receptores humanos de reconhecer milhares de odorantes. Ligantes odorantes foram publicados para menos de 6% dos receptores humanos 1-11. Esta falta de dados é devido, em parte, às dificuldades funcionalmente que expressam estes receptores em sistemas heterólogos. Aqui, nós descrevemos um método para expressar a maioria da família do receptor olfactivo, em células Hana3A, seguido por uma avaliação de elevado rendimento de activação do receptor olfactivo utilizando um ensaio de repórter de luciferase. Este ensaio pode ser usado para (1) painéis de tela de odorantes contra painéis de receptores olfactivos; (2) confirmar a interação odorante / receptor via curvas de dose-resposta; e (3) comparar os níveis de ativação dos receptores entre variantes de receptores. Em nossos dados da amostra, 328 receptores olfativos foram triados contra 26 odorantes. Pares Odorant / receptores com diferentes contagens de resposta foram selected e testado em resposta à dose. Estes dados indicam que um ecrã é um método eficaz para enriquecer os pares odorante / receptoras que vai passar uma experiência de resposta a dose, isto é, os receptores que têm uma resposta bona fide para um odorante. Portanto, este ensaio de luciferase de alto rendimento é um método eficaz para caracterizar olfativo receptores de um passo essencial em direção a um modelo de codificação odor no sistema olfativo dos mamíferos.
Introduction
O sistema olfactivo dos mamíferos tem a capacidade de responder a um grande número de estímulos odoríferos, permitindo a detecção e a discriminação de milhares de odorantes. Receptores olfativos (RUP) são os sensores moleculares expressas pelos neurônios sensoriais olfativos no epitélio olfativo 12. Reconhecimento odor de mamíferos ocorre através da ativação diferencial das RUP por odores, ea família ou gene é extensa, com cerca de 1.000 murino e 400 receptores humanos 12-16. Análises funcionais anteriores do RUP em neurônios olfativos e em células heterólogas têm demonstrado que diferentes odores são reconhecidos pela única, mas a sobreposição de conjuntos RUP 10,17-20. Ligantes Correspondência para RUP é fundamental para a compreensão do código olfativo e essencial para a construção de modelos viáveis de olfato. Devido às dificuldades de expressar RUP em sistemas heterólogos, bem como o grande número de ambos os odorantes e RUP, estes dados tem sido largamente ausente do field; de facto, menos de 6% de RUP humanos têm um ligando publicado 1-11. Este protocolo descreve o uso de um ensaio de luciferase para a caracterização do odorante / ou interacções. Este ensaio permite a caracterização de alto rendimento das RUP, uma tarefa que é essencial para a compreensão de odorante / ou interações, bem como o desenvolvimento de um modelo de codificação odor.
Estudos de alto rendimento de RUP enfrentam três grandes desafios. Primeiro, RUP expressos em células heterólogas foi retida no ER e subsequentemente degradados no proteassoma 21,22, impedindo as RUP de interagir com odorantes no sistema de ensaio de 23-25. Este problema foi resolvido com a descoberta de proteínas acessórias que facilitam a expressão da superfície celular estável de uma ampla gama de RUP 19,26,27. Receptor-transportador proteínas 1 e 2 (RTP 1 e 2) promover a expressão ou da superfície celular e activação em resposta à estimulação do odorante 19. Com base neste trabalho, células HEK293T forammodificada para expressar de forma estável a longo RTP 1 (RTP1L) e RTP 2, receptor de aumentar a expressão da proteína 1, e L αolf, resultando na linha celular Hana3A 19,27. Além disso, o receptor de acetilcolina de tipo 3 muscarínica (M3-R) interage com o RUP na superfície da célula e aumenta a activação em resposta aos odores 26. A co-transfecção de um OU com RTP1S e M3-R em Hana3A células resulta na expressão robusta, consistente, e funcional de uma ampla gama de RUP na superfície da célula 27. Em segundo lugar, mamíferos ou repertórios são bastante grandes. Nos seres humanos, por exemplo, o repertório OR é uma ordem de magnitude mais numerosos do que o repertório de receptores gustativos, e duas ordens de magnitude mais numerosos do que o repertório de receptor visual. Embora a clonagem de um único OR é um protocolo relativamente simples, o esforço up-front significativa é necessária para gerar uma biblioteca abrangente. Em terceiro lugar, embora saibamos que na visão, comprimento de onda se traduz em cor ena freqüência de audição se traduz em campo, a organização de odores é mal compreendida, o que torna difícil para os pesquisadores para interpolar a partir de uma amostra representativa de odorantes. Apesar de alguns progressos foram feitos nesta frente 10,28, o mapa da paisagem olfativa permanece incompleta. Triagem dezenas de milhares de moléculas contra centenas de RUP é uma tarefa difícil; telas de alto rendimento neste domínio exigem campanhas cuidadosamente definidos. Os principais desafios que restam são as de logística e custo, em vez de problemas inerentes à técnica. Apesar de triagem heteróloga não tem sido amplamente utilizada para identificar ligantes por grupos acadêmicos, uma empresa privada tem usado a mesma técnica para identificar ligantes para 100 RUP humanos 29. Infelizmente, esses dados são proprietários.
O ensaio de luciferase de elevado rendimento descrita aqui tem várias vantagens sobre os métodos alternativos utilizados para avaliar ou activação. Embora a responses de neurônios olfatórios nativas foram medidos utilizando eletrofisiologia e de imagem de cálcio, estas técnicas têm dificuldade provocando além OR que leva à resposta de um neurônio devido à sobreposição de propriedades de resposta de neurônios olfativos. Embora a bater-se um tipo de receptor marcado com GFP 30,31, entregando receptores específicos através de adenovirus para murino neurónios olfactivos 32,33, ou realizando RT-PCR após gravações 17,24,33 pode ligar gravações de tipos de receptores individuais, estes métodos são baixo rendimento e não é adequado para telas de grande escala. Sistemas de rastreio heterólogas são mais escalável e duas formas principais são encontradas na literatura: repórteres via inositol trifosfato de acampamento e (IP3) repórteres da via. Após a estimulação de odor, RUP activar uma cascata de sinalização L transdução αolf que resulta na produção de AMP cíclico (AMPc) 12. Por co-transfecção de um gene repórter da luciferase de pirilampo sob o controlo de ACElemento de resposta a AMP (CRE), a produção de luciferase pode ser medido como uma função de resposta de odor, o que permite a quantificação de OU activação. OU a activação pode também ser ligada à via de IP3 por co-expressando proteínas-G tais como G α15/16 ou um L-α15 olf quimera 24,25,34. Nós escolhemos o ensaio aqui apresentado com base em três fatores: (1) a co-expressão da RTP1 com receptores olfativos Rho-tag melhora a expressão de receptores olfativos na superfície da célula 19,27; (2) utilização de um gene repórter de AMPc-responsiva permite a medição de OU activação através da via do segundo mensageiro canónica; e (3) o ensaio é adequado para telas de alto rendimento.
Este ensaio de luciferase de alta produtividade é aplicável a uma variedade de estudos valiosos para o campo do olfacto. Primeiro, um grande número de RUP podem ser rastreados contra um único odorante, a fim de determinar o padrão de activação do receptor por um spodorante ESPECÍFICOS. Este tipo de estudo identificou OR7D4 como o OR responsável por responder ao androstenona odorante esteróide 8. Por outro lado, uma ou podem ser rastreados contra um painel de odores, a fim de determinar o perfil de resposta do receptor de 10. Quando o candidato olfactiva odorante / OU pares são identificados através dessas telas, a interacção pode ser confirmada através da realização de uma experiência de resposta à dose de exame da resposta do OR a concentrações crescentes de odorante. Curvas de resposta de dose também pode avaliar como a variação genética em um OR afeta em resposta odorante vitro 8,9,11,35, e esses estudos podem ser estendidos para interespecífica ou a variação, permitindo a análise da evolução receptor entre espécies e mutações causais em evolução 36,37, Finalmente, este ensaio pode ser usado para o rastreio de antagonistas de odor, que são capazes de antagonizar a resposta ao OU um odorante particular para um par odorante / receptor conhecido 38,39. Em resumo, esta altaEnsaio de luciferase-throughput é aplicável a uma gama de estudos que ajudarão caracterizar ou padrões de ativação e proporcionar uma melhor compreensão da codificação odor no sistema olfativo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Identidade Odorant é codificada por padrões de ativação dos receptores olfativos, mas padrões de ativação dos receptores, incluindo os receptores que são ativados e em que grau, são conhecidos por menos de 6% dos receptores olfativos humanos 1-11. Os esforços para caracterizar receptores olfativos têm sido limitados por seus métodos de trabalho intensivo ou aplicabilidade a apenas um subconjunto da família de receptores olfativos 17,23,24,33,34. O sistema de expressão heterólogo Hana…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabalho foi apoiado por R01 DC013339, R03 DC011373 e Ruth L. Kirschstein Serviço Nacional Research Award T32 DC000014. Uma parte do trabalho foi realizada através do Monell Chemosensory Receptor Signaling Core, que é suportado, em parte, pelo financiamento do P30 DC011735 NIH-NIDCD Núcleo Grant. Os autores agradecem C. Sezille para obter ajuda com a coleta de dados.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Hana3A cells | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| RTP1S-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| M3-R-pCI | Avaiable from the Matsunami Laboratory upon request | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (without Ca2+ and Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | PBS |
| Trypsin (0.05% Trypsin EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsin |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| 96 well PDL white/clear plate | BD BioCoat | 356693 | plates |
| Lipid transfection reagent: Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Firefly luciferase substrate, firefly luciferase quencher/Renilla luciferase substrate: Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 | BioTek | SLAD | BioTek S2 |
| Microplate reader software: Gen5 Data Analysis Software | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300ul GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5ul GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300ul GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | XYZ tips |
| 12.5ul GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | XYZ tips |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | DMSO |
| forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
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