Modèles d'activation des récepteurs olfactifs codent l'identité de l'odeur, mais le manque de données publiées identification des ligands odorants pour les récepteurs olfactifs de mammifères entrave le développement d'un modèle complet de codage de l'odeur. Ce protocole décrit un procédé pour faciliter l'identification à haut débit de ligands de récepteurs olfactifs et la quantification de l'activation du récepteur.
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Article de méthode
Analyse à haut débit de mammifères olfactifs récepteurs: mesure de activation du récepteur via la luciférase activité
Dans cet article
Résumé
Résumé
Odorants créer des motifs uniques et se chevauchant de l'activation du récepteur olfactif, ce qui permet une famille d'environ 1000 et 400 murin récepteurs humains de reconnaître des milliers de substances odorantes. Ligands odorants ont été publiés pour moins de 6% des récepteurs humains 1-11. Ce manque de données est dû en partie à la difficulté à exprimer fonctionnellement ces récepteurs dans des systèmes hétérologues. Ici, nous décrivons une méthode pour exprimer la majorité de la famille des récepteurs olfactifs dans des cellules Hana3A, suivi d'une évaluation à haut débit de l'activation du récepteur en utilisant un test olfactif rapporteur de la luciférase. Ce dosage peut être utilisé pour (1) des panneaux d'écran de substances odorantes contre les panneaux de récepteurs olfactifs; (2) confirmer interaction odorant / récepteur via des courbes dose-réponse; et (3) comparer les niveaux d'activation du récepteur entre les variants du récepteur. Dans nos données d'exemple, 328 récepteurs olfactifs ont été projetés contre 26 odorants. Paires odorant / récepteurs avec des scores variant de réponse étaient de sélectionted et testé en réponse à la dose. Ces données indiquent que l'écran est une méthode efficace pour enrichir en paires odorant / récepteurs qui vont passer d'une expérience de dose-réponse, à savoir les récepteurs qui ont une réponse de bonne foi à une substance odorante. Par conséquent, ce dosage de la luciférase à haut débit est une méthode efficace pour caractériser les récepteurs-une étape essentielle olfactif vers un modèle de codage d'odeur dans le système olfactif de mammifère.
Introduction
Le système olfactif de mammifère a la capacité de répondre à un grand nombre de stimuli odorants, permettant la détection et la discrimination des milliers de substances odorantes. Les récepteurs olfactifs (RUP) sont les capteurs moléculaires exprimés par les neurones sensoriels olfactifs dans l'épithélium olfactif 12. La reconnaissance de l'odeur de mammifère se produit par l'activation différentielle des RUP par odorants, et la famille ou le gène est vaste, avec environ 1000 murin et 400 récepteurs humains 12-16. Analyses fonctionnelles antérieures de RUP dans les neurones olfactifs et dans les cellules hétérologues ont montré que ....
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Protocole
1. Culture de cellules Hana3A
- Préparer des milieux M10 en complétant le milieu essentiel minimum (MEM) avec 10% (v / v) de FBS.
- Culture Entretien
- Maintenir les cellules dans les médias M10. REMARQUE: Les vecteurs d'expression pour RTP1L, RTP2, REEP1, et G αolf confèrent une résistance à la puromycine à cellules Hana3A, mais le maintien des cellules avec cet antibiotique n'affecte pas significativement les résultats du dosage.
- Subculture à un rapport de 1:8 en boîtes de 10 cm tous les 2-3 jours.
- Incuber à 37 ° C avec 5% de CO 2.
2. Cellules de pla....
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Résultats
Un écran primaire testé 328 RUP contre 26 odeurs à une concentration de 100 uM. Cette concentration d'odeur a été démontrée pour activer efficacement une grande proportion des RUP avec des ligands connus 10. Tout d'abord, l'activité de la luciférase normalisée a été calculée en divisant la lecture de la luciférase de luciole par la luciférase de Renilla lecture. Ensuite, les valeurs baselined ont été calculées en soustrayant les lectures de la luciférase normalisée pour la commande de pas.......
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Discussion
Identité odorant est codé par des motifs d'activation des récepteurs olfactifs, mais les modèles d'activation des récepteurs, y compris les récepteurs qui sont activées et à quel degré, sont connus pour moins de 6% des récepteurs olfactifs humains 1-11. Les efforts visant à caractériser les récepteurs olfactifs ont été limités par leurs méthodes ou de l'applicabilité de main-d'œuvre à un sous-ensemble de la 17,23,24,33,34 de famille de récepteur olfactif. Le système d'expression.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à révéler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par R01 DC013339, R03 DC011373, et Ruth L. Kirschstein Service national de la recherche Prix T32 DC000014. Une partie des travaux a été réalisée en utilisant le Monell Chemosensory signalisation des récepteurs de base, qui est pris en charge, en partie, par le financement de la P30 DC011735 NIH-NIDCD base Grant. Les auteurs remercient C. Sézille de l'aide à la collecte de données.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Cellules Hana3A | Disponibles auprès du Laboratoire Matsunami sur demande | ||
| RTP1S-pCI | Disponibles auprès du Laboratoire Matsunami sur demande | ||
| M3-R-pCI | Disponibles auprès du Laboratoire Matsunami sur demande | ||
| pCRE-luc | Agilent | 219076 | LUC |
| pSV40-RL | Promega | E2231 | RL |
| Minimum Essential Media, Eagle | Sigma Aldrich | M4655 | MEM |
| FBS | Life Technologies | 16000-044 | FBS |
| PBS (sans Ca2+ et Mg2+) | Cellgro | 21-040-CV | a href="http://cellgro.com/products/balanced-salt-solutions/phosphate-buffered-saline/phosphate-buffered-saline-1x-2.html">PBS |
| Trypsine (0,05 % de trypsine EDTA) | Life Technologies | 25300 | Trypsine |
| CD293 | Life Technologies | 11913-019 | CD293 |
| >96-well PDL blanc/transparent | plaque BD BioCoat | 356693 | plaques |
| Réactif de transfection lipidique : Lipofectamine 2000 | Life Technologies | 11668-019 | Lipofectamine |
| Substrat de luciférase Firefly, quencher luciferase Firefly luciferase/Renilla substrat de luciférase : Dual-Glo Assay | Promega | E2980 | dual glo |
| Synergy S2 ; | BioTek | SLAD | a href="http://www.biotek.com/products/microplate_detection/synergy2_multimode_microplate_reader.html">BioTek S2 |
| Logiciel de lecture de microplaques : Gen5 Logiciel d’analyse de données | BioTek | Gen5 | Gen5 |
| BIOSTACK | BioTek | BIOSTACK2WR | BioStack |
| Multiflo | BioTek | MFP | MultiFlo |
| 300 μ ; l GripTips | Integra | 4433 | GripTips |
| 12.5 μ ; l GripTips | Integra | 4414 | GripTips |
| 300 μ ; l GripTips ViaFlo96 | Integra | 6433 | pointes XYZ |
| 12.5 μ ; l GripTips 384 XYZ | Integra | 6403 | pointes XYZ |
| 384ViaFlo | Integra | 6030 | 384ViaFlo |
| TE buffer | Macherey Nagel | 740797.1 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D2650-100ML | a href="http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d2650?lang=en& ; region=US">DMSO |
| Forskolin | Enzo Life Sciences | BML-CN100-0010 | FOR |
Références
- Wetzel, C. H., Oles, M., Wellerdieck, C., Kuczkowiak, M., Gisselmann, G., Hatt, H. Specificity and sensitivity of a human olfactory receptor functionally expressed in human embryonic kidney 293 cells and Xenopus Laevis oocytes. The Journal of neuroscience the official journal of the Society for Neuroscience. 19 (17), 7426-7433 (199....
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Réimpressions et autorisations
