En<em> Ex vivo</em> Kultur System til Studieinformationen Thyroid Development

Summary

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Abstract

Skjoldbruskkirtlen er en bilobated endokrin kirtel lokaliseret ved bunden af ​​halsen, der producerer thyroidhormoner T3, T4 og calcitonin. T3 og T4 er produceret af differentierede thyrocytter, organiseret i lukkede områder kaldet hårsække, mens calcitonin syntetiseret af C-celler, afbrudt i mellem follikler og et tæt net af blod kapillærer. Selv voksne skjoldbruskkirtlen arkitektur og funktioner er blevet udførligt beskrevet og studeret, dannelsen af ​​de "angio-follikulært" enheder, fordelingen af ​​C-celler i parenkym og parakrine kommunikation mellem epitel og endotelceller er langt fra at blive forstået.

Denne metode beskriver sekventielle trin af muse embryonale skjoldbruskkirtlen anlagen dissektion og dets kultur på semiporous filtre eller på mikroskopi plastik dias. Inden for en periode på fire dage, denne kultur-system trofast rekapitulerer in vivo skjoldbruskkirtlen udvikling. Faktisk (i) miaobation af organet forekommer (for E12.5 eksplantater), (ii) thyrocytter forstadier organisere sig i follikler og polariserer (iii) thyrocytter og C-celler differentierer, og (iv) endotelceller stede i Mikrodissekterede væv formere, migrerer ind i thyreoidea lapper, og arbejde tæt sammen med de epitelceller, som de gør i vivo.

Skjoldbruskkirtel væv kan opnås fra vildtype, knockout eller fluorescerende transgene embryoner. Desuden eksplantater kultur kan manipuleres ved tilsætning af inhibitorer, blokerende antistoffer, vækstfaktorer, eller endog celler eller konditioneret medium. Ex vivo-udvikling kan analyseres i realtid, eller på ethvert tidspunkt af kulturen ved immunfarvning og RT-qPCR.

Konklusionen er, skjoldbruskkirtel explant kultur kombineret med nedstrøms hel-mount eller på strækninger billedbehandling og genekspressionsprofilering giver et kraftfuldt system til at manipulere og studere morfogenetiske og differentiering begivenheder skjoldbruskkirtlen organogenesis.

Introduction

Skjoldbruskkirtlen er en samling af uafhængige epitelial kugler, kaldet hårsække, omgivet af et fintmasket net af endotel kapillærer. Denne organisation giver skjoldbruskkirtel funktion: endotel kapillærer give thyrocytter med jod, der kræves for T3 og T4 hormon syntese og distribuere disse sidstnævnte til hele kroppen. Spredt mellem de hårsække og kapillærer, C-celler producerer hypocalcæmiske hormon calcitonin ^1. Selv voksne skjoldbruskkirtlen arkitektur og funktioner er velkendte, de cellulære og molekylære mekanismer involveret i skjoldbruskkirtlen embryonale udvikling (follikelstimulerende dannelse og differentiering), er langt fra at blive forstået.

Under embryogenese, thyrocytter progenitor stammer som en fortykkelse (midterlinjen Anlage), i den ventrale væg foregut endoderm på embryonisk dag (e) 8.5 i museembryo, mens C-celler progenitorer stamme fra e11.5 som dråbe-formede fremspring ( den ultimobranchial bodør) i fjerde svælg poser ^2-6. Midterlinjen knop derefter frigøres fra endodermen udvider bilateralt til at smelte ved E13.5 med ultimobranchial organer på hver side af trachea. Endelig thyrocytter organisere sig i follikler og C-celler differentierer.

Aktuel viden om skjoldbruskkirtlen dannelse kommer hovedsageligt fra histologisk analyse af faste væv, men de morfogenetiske begivenheder involveret i skjoldbruskkirtlen dannelse er meget dynamisk og involverer kommunikation og interaktion mellem forskellige celletyper og med den ekstracellulære matrix. Tidligere arbejde viste, at thyrocyte progenitorer producerer høje niveauer af VEGF til at rekruttere endotelceller til at udvikle skjoldbruskkirtlen, og til gengæld, ansat endotelceller fremme follicle dannelse og C-celler differentiering ^7.

De fleste ex vivo undersøgelser af skjoldbruskkirtlen er blevet udført på isolerede voksne thyreoidea-afledte celler dyrket enten 2D vævsdyrkningsplastik dishes eller i 3D matricer. Ved hjælp af disse typer af kulturer, differentierede follikelceller enten forblive polariseret og organiseret som hårsække eller generhverve en 3D organisation ^8-10. Men disse rene epitelceller eksplanterede fra deres fysiologisk miljø, og dyrket i 2D, ignorere interaktioner med ekstracellulære matrix, cytokiner, vækstfaktorer og med andre celletyper, såsom endotelceller eller nerver celler, som de normalt støder på in vivo. En meget flot undersøgelse for nylig beskrevet en differentiering protokol af ES-celler i skjoldbruskkirtlen hårsække ved hjælp af et sidste skridt kultur i 3D matrigel ^11. Men disse 3D-kulturer mangler kontakt med andre celletyper.

Baseret på tidligere ekspertise på bugspytkirtlen og spytkirtlerne organkultur ^12-14, en fremgangsmåde til at dissekere musefostre skjoldbruskkirtlen anlagen og dyrkning eksplantaterne på semiporous filtre eller på mikroskopi plast dias blev udviklet.

Hvornårarbejder med E12.5 embryoer, den dobbelte oprindelse i skjoldbruskkirtlen anlagen (midterlinjen anlage og de to laterale ultimobranchial organer) indførte mikrodissektion af et stort fragment af væv. Dette indeholdt luftrøret, men ikke spiserøret og udvidet fra buen arterier op til arytenoid hævelse. Når dyrket på filtre, midterlinjen Anlage strækker sig sideværts på hver side af luftrøret, hvor de smelter sammen med ultimobranchial organer til dannelse af de to skjoldbruskkirtlen lapper, der stadig er forbundet med en smal landtange.

I kultur, epitelceller formere sig, organisere sig i hårsække og differentiere i thyrocytter og C-celler, afhængigt af deres oprindelse. Endotelceller indeholdt i mikrodissekeres væv også formere sig og invadere skjoldbruskkirtlen lapper til endelig at knytte tæt sammen med epitelial follikulært struktur, uafhængigt af blodgennemstrømning eller cirkulerende faktorer. Da udviklingen af eksplantaterne trofast rekapitulerer in vivo udvikleling, denne kultur-system er optimal til at studere morfogenetiske og differentiering begivenheder i skjoldbruskkirtlen udvikling.

Skjoldbruskkirtel væv kan opnås fra vildtype, knockout eller fluorescerende transgene embryoner og kulturen systemet er modtagelig for tab og gevinst-of-funktion eksperimenter. Endelig kunne time-lapse billeddannelse af fluorescens-mærkede skjoldbruskkirtlen eksplanteret på mikroskopi plast retter udnyttes til bedre undersøge kinetik og kontinuitet i morfogenetiske bevægelser, der forekommer in vivo. Time-lapse imaging er allerede blevet brugt til at studere forgrening morfogenese i bugspytkirtlen ^15,16 eller ureteric opløbet ^17..

Protocol

Mus blev rejst og behandlet i overensstemmelse med principperne for laboratoriedyr pleje af University Animal Welfare udvalget. Alle procedurer og protokoller blev godkendt af udvalget. 1.. Coating af Mikroskopi Plastic Kultur Chambers BEMÆRK: Udfør alle følgende trin under sterile forhold i en laminar flow hætte. De to typer af belægning er funktionelt ækvivalente. Coat plast kultur kamre med fibronektin en dag før isolering af skjoldbruskkirtl…

Representative Results

Thyreoidea anlages (midterlinjen og UB, sammen med omgivende væv), og skjoldbruskkirtel lapper dissekeres fra museembryoer på E12.5 og e13.5/e14.5 henholdsvis (figur 1). Efter en dag i kultur på filter midterlinjen Anlage er synlig (figur 2A) som et langstrakt væv spænder oven på luftrøret. Den gradvist danner to kamre på hver side af trachea. Hvis isolerede skjoldbruskkirtlen lapper (E13.5 eller E14.5) dyrkes, vil de udvide, undergår morfogenese og epitelceller vil organisere …

Discussion

Dette papir beskriver en metode til at dissekere og dyrkning skjoldbruskkirtlen eksplantaterne (E12.5) eller lapper (E14.5) for at studere og bedre forstå de komplekse begivenheder, der førte til skjoldbruskkirtlen dannelse. På grund af den dobbelte oprindelse skjoldbruskkirtlen anlagen (midterlinjen Anlage og de to laterale ultimobranchial organer) og deres lille størrelse, et fragment af E12.5 væv lokaliseret rostralt til buen arterier og indeholdende luftrøret, men ikke spiserøret er mikrodissekeres. Som illus…

Materials

µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile	proxylab	80826
Collagen Type I, rat tail	Millipore	08-115
Fibronectin from human plasma	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Tungsten wire	Goodfellow	LS237450
culture plate insert (12 mm diameter)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261