Uma<em> Ex vivo</em> Sistema Cultura para estudar o desenvolvimento da tireóide

Summary

This protocol describes dissection of mouse embryonic thyroid anlagen and the culture of explants on semiporous filters or on microscopy plastic slides. This system is ideal to study morphogenetic or differentiation events occurring during thyroid development of wild type or knockout embryos, and is amenable to gain- and loss-of-function experiments.

Abstract

A tiróide é uma glândula endócrina bilobated localizada na base do pescoço, produzindo as hormonas da tiróide T3, T4, e de calcitonina. T3 e T4 são produzidos por tireócitos diferenciados, organizados em esferas fechadas chamadas folículos, enquanto que a calcitonina é sintetizado por células C, intercalados entre os folículos e uma densa rede de capilares sanguíneos. Embora arquitectura tiróide adulta e funções têm sido extensivamente estudada e descrita, a formação das unidades de "angio-foliculares", a distribuição de células C no parênquima e as comunicações parácrinas entre células epiteliais e endoteliais está longe de serem compreendidos.

Este método descreve os passos seqüenciais de rato tireóide embrionário anlagen dissecção e sua cultura em filtros semiporous ou em lâminas de plástico de microscopia. Dentro de um período de quatro dias, este sistema de cultura recapitula fielmente no desenvolvimento da tiróide in vivo. Com efeito, (i) bilobation do órgão ocorre (por explante E12.5), (ii) tireócitos precursores organizar-se em folículos e polarizar, (iii) tireócitos e diferenciar células C, e (iv) as células endoteliais presentes no tecido microdissecção proliferam, migram para a lobos da tireóide, e intimamente associado com as células epiteliais, como o fazem in vivo.

Tecidos da tireóide pode ser obtido a partir de tipo selvagem, nocaute ou embriões transgênicos fluorescentes. Além disso, a cultura de explantes pode ser manipulada pela adição de inibidores, anticorpos bloqueadores, factores de crescimento, ou até mesmo células ou meio condicionado. Ex vivo de desenvolvimento pode ser analisado em tempo real, ou a qualquer momento da cultura por imunocoloração e RT-qPCR.

Em conclusão, a cultura explante tireóide combinado com toda a jusante de montagem ou em seções de imagem e expressão gênica profiling fornece um sistema poderoso para manipular e estudar eventos morfogenéticos e diferenciação de tiróide organogenesis.

Introduction

A glândula tireóide é uma coleção de esferas epiteliais independentes, chamados folículos, cercado por uma densa rede de capilares endoteliais. Esta organização permite que a função da tireóide: capilares endoteliais fornecer tireócitos com iodo, necessários para T3 e T4 síntese de hormônios e distribuir estes últimos para todo o corpo. Espalhados entre os folículos capilares e, células C produzir o hormônio calcitonina hypocalcemic ^1. Embora a arquitetura e as funções da tireóide adulto são bem conhecidos, os mecanismos celulares e moleculares envolvidos no desenvolvimento embrionário da tireóide (formação e diferenciação do folículo) estão longe de serem compreendidos.

Durante a embriogênese, tireócitos progenitor origina como um espessamento (o primórdio da linha média) da parede ventral da endoderme foregut no dia embrionário (e) 8,5 no embrião de rato, enquanto células C progenitores originam em E11.5 como saliências em forma de gota ( o bo Ultimobranquialmorre) da quarta bolsas faríngeas ^2-6. O botão da linha média, em seguida, se desprende da endoderme, expande bilateralmente para fundir em E13.5 com os corpos Ultimobranquial de cada lado da traquéia. Finalmente, tireócitos organizar em folículos e células C diferenciar.

O conhecimento atual sobre a formação da tireóide vem principalmente da análise histológica dos tecidos fixos, mas os eventos morfogenéticos envolvidos na formação da tireóide são muito dinâmicos e envolvem comunicações e interações entre os diferentes tipos de células e com a matriz extracelular. Trabalhos recentes mostraram que os progenitores tirócito produzir níveis elevados de VEGF para recrutar células endoteliais para o desenvolvimento da tiróide, e, por sua vez, recrutados células endoteliais e promover a formação de folículo células C diferenciação ^7.

A maioria dos estudos in vivo ex sobre a tireóide foram realizados em células derivadas de tireóide adultos isolados, produzidas quer em 2D cultura de tecidos de plástico dparóquias ou em matrizes 3D. Usando esses tipos de culturas, as células foliculares diferenciados ou permanecem polarizadas e organizados como folículos ou reaquisição uma organização 3D ^8-10. No entanto, estas células epiteliais pura, explantadas de seu ambiente fisiológico, e cultivadas em 2D, ignorar as interacções com a matriz extracelular, citocinas, factores de crescimento e com outros tipos de células tais como as células endoteliais ou nervos que normalmente encontrar in vivo. Um estudo muito bom descreveu recentemente um protocolo de diferenciação de células-tronco embrionárias em folículos tireoidianos usando uma etapa final cultura em matrigel 3D ^11. No entanto, a falta de contacto com outros tipos celulares nestas culturas 3D.

Com base em experiência anterior no pâncreas e glândulas salivares de cultura de órgãos ^{de 12-14,} um método para dissecar rato embrionário Anlagen tiróide e cultivar os explantes sobre filtros semiporous ou em lâminas de microscopia de plástico foi desenvolvido.

Quandotrabalhar com embriões E12.5, a dupla origem da anlagen da tireóide (o primórdio da linha média e os dois corpos laterais Ultimobranquial) impôs a microdissecção de um grande fragmento de tecido. Este continha a traquéia, mas não o esôfago, e se estendia desde o arco faríngeo artérias até o inchaço aritenóide. Quando cultivadas em filtros, o primórdio da linha média se estende lateralmente de cada lado da traqueia, onde fundem com os corpos Ultimobranquial para formar os dois lóbulos da tiróide, ainda ligados por um estreito istmo.

Em cultura, as células epiteliais proliferam, organizam-se em folículos e diferenciam-se em tireócitos e células C, dependendo da sua origem. As células endoteliais contidas no tecido microdissecção também proliferam e invadem os lobos tireoidianos para finalmente associar estreitamente com a estrutura folicular epitelial, independentemente do fluxo de sangue ou fatores circulantes. Como o desenvolvimento dos explantes recapitula fielmente in vivo desenvolvermento, este sistema de cultura é ideal para estudar morfogenética e eventos de diferenciação que ocorrem durante o desenvolvimento da tiróide.

Tecidos da tireóide pode ser obtido a partir de tipo selvagem, nocaute ou embriões transgênicos fluorescentes, eo sistema de cultura é passível de experimentos de ganho de função de perda de e. Finalmente, time-lapse de imagens de explantes de tireóide fluorescente etiquetado em pratos de plástico de microscopia pode ser explorada para melhor investigar a cinética ea continuidade dos movimentos morfogenéticos que ocorrem in vivo. Time-lapse imagem já foi usada para estudar ramificação morfogênese do pâncreas ^15,16 ou broto ureteral ^17.

Protocol

Ratos foram levantadas e tratadas de acordo com os princípios de cuidados com animais de laboratório do Comitê de Bem-Estar Animal da Universidade. Todos os procedimentos e protocolos foram aprovados por esta Comissão. 1. Revestimento de Microscopia de plástico Chambers Cultura NOTA: Executar os seguintes passos sob condições estéreis numa câmara de fluxo laminar. Os dois tipos de revestimento são funcionalmente equivalentes. Câmaras de cult…

Representative Results

Anlages Tiróide (linha média e UB, juntamente com tecidos adjacentes), e os lóbulos da tiróide são dissecados a partir de embriões de rato E12.5 e no e13.5/e14.5, respectivamente (Figura 1). Após um dia de cultura no filtro, o primórdio da linha média é visível (Figura 2A), como um tecido alongado abrangendo no topo da traqueia. Ele forma progressivamente dois lobos de cada lado da traqueia. Se lobos tireoidianos isolados (E13.5 E14.5) ou são cultivadas, eles vão expandir-s…

Discussion

Este artigo descreve um método para dissecar e cultivo de explantes de tireóide (E12.5) ou lóbulos (E14.5), a fim de estudar e compreender melhor os eventos complexos que levam à formação da tiróide. Devido à dupla origem do Anlagen tiróide (o primórdio da linha média e os dois corpos laterais Ultimobranquial), e seu pequeno tamanho, um fragmento de tecido E12.5 rostral localizada nas artérias arco da faringe, e contendo a traqueia, mas não o esófago é microdissectados. Tal como ilustrado, dentro de um pe…

Materials

µ-slide 8 well, ibiTreat, tissue culture treated, sterile	proxylab	80826
Collagen Type I, rat tail	Millipore	08-115
Fibronectin from human plasma	Invitrogen	# 33010-018
M199	Invitrogen	31150-022
HBSS	Invitrogen	14025-100
Tungsten wire	Goodfellow	LS237450
culture plate insert (12 mm diameter)	Millipore	PICM01250
GlycoBlue	Invitrogen	AM9516
E-cadherin	BD Biosciences	610182	1/1000
Ezrin	Thermo Scientific	MS-661-P1	1/400
PECAM	BD Biosciences	550274	1/100
Hoechst	Sigma	B2261