ניתוח מקיף של תמלול Dynamics מדוגמאות המוח בעקבות ניסיון התנהגות

Summary

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Abstract

הקידוד של חוויות במוח ובאיחוד של זכרונות לטווח ארוך תלוי בשעתוק הגנים. זיהוי הפונקציה של גנים מסוימים בניסיון קידוד הוא אחד מהיעדים המרכזיים של מדעי מוח מולקולריים. יתר על כן, העמותה הפונקציונלית של גנים מוגדרים עם התנהגויות ספציפיות יש השלכות על הבנת הבסיס של הפרעות נוירופסיכיאטריות. אינדוקציה של תוכניות שעתוק חזקות נצפתה במוחם של העכברים הבאים מניפולציות התנהגותיות שונות. בעוד שחלק מאלמנטים גנטיים מנוצלים שוב ושוב הבא מניפולציות התנהגותיות שונות ובגרעינים שונים במוח, תוכניות תעתיק הן כללית ייחודיות לגירויים התרמה והמבנה שבו הם למדו ^1,2.

בפרסום זה, פרוטוקול מתואר לפרופיל תעתיק חזק ומקיף מגרעיני המוח של עכברים בתגובה למניפולציה התנהגותית.הפרוטוקול בא לידי הביטוי בהקשר של ניתוח של דינמיקת ביטוי גנים בגרעין נסמך הבא ניסיון קוקאין חריף. לאחר שהוגדר בניסיון vivo, הרקמה העצבית היעד היא גזור; ואחריו טיהור RNA, להפוך שעתוק וניצול של מערכי microfluidic לניתוח qPCR מקיף של גני המטרה מרובים. פרוטוקול זה מיועד לניתוח מקיף (פונה 50-500 גנים) של הגבלת כמויות של חומר מוצא, כגון דגימות מוח קטנות או אפילו תאים בודדים.

הפרוטוקול הוא הכדאי ביותר לניתוח מקביל של דגימות מרובות (למשל תאים בודדים, ניתוח דינמי הבאים תרופות, נגיפי או הפרעות התנהגות). עם זאת, הפרוטוקול יכול גם לשמש להבטחת האפיון ואיכות של דגימות לפני לימודי כל הגנום על ידי microarrays או RNAseq, כמו גם אימות של נתונים המתקבלים ממחקרי הגנום.

Introduction

הארגון הדינמי של המוח מאפשר גמישות מחשבתית והתנהגות. חוויות מקודדות באמצעות שינויים במבנה ובחוזק של קשרים בין תאי עצב במוח ^3. זה "גמישות ניסיון תלוי" היא התוצאה של גיוס של דפוסים ספציפיים של ביטוי גנים המספק את החלבונים הדרושים לשינוי של מבנה וכוח ⁴ הסינפטי. זיהוי של רשתות רגולטוריות גן תיווך ההיווצרות של זכרונות לטווח ארוך הוא עיקרון של מדעי מוח המולקולריים מרכזי, עם הציפייה שהזדהות האלמנטים הדומיננטיים של תוכניות תעתיק תספק תובנה לתוך עקרונות יסוד המסדירים את היווצרות זיכרון, כמו גם מטרות ל טיפול בניוון עצבי והפרעות נוירופסיכיאטריות. תוכניות תעתיק להתפתח בגלי temporally מוגדרים, כל אחד מהם לקודד גנים של אופי שונה, שהם חשובים עבור דשלבי ifferent ביישום לתוצאה של אירוע איתות ^1,2. לכן חשוב לטפל בדינמיקת תעתיק על לוח זמנים זמניים מפורטים, על מנת לזהות את ההשלמה המלאה של גנים המושרה, ולקבל תובנה פונקצית הפוטנציאל שלהם בהתאם לדינמיקה של גיוסם.

התמכרות לסמים היא צורה חזקה של פלסטיות ניסיון תלוי הנגרמת על ידי ההשפעות ארוכות טווח של תרופות של התעללות במעגלים עצביים במוח ^5,6. חשיפה ראשונית, חריפה לתרופות עלולה להוביל להתפתחות של התמכרות ומעבר לשימוש כרוני. מידע מקושרת הוא אלמנט מכריע בהתפתחות של התמכרות. רמזים סביבתיים הקשורים לסמים מוקצים חשיבות משמעותית במוחם של משתמשים בסמים. מידע מקושרת והזכיר מתעלל תרופה של ניסיון בסמים בעבר יכול לגרום להישנות להשתוקקות לסמים גם לאחר תקופות של התנזרות ארוכות מחשיפה לסמים ^7,8.מכאן האתגר הגדול הקליני בהתמכרות – הנטייה של מכורים שמפסיק אפילו זמן רב לאחר תסמיני גמילה שככו ^9.

רגישות התנהגות לקוקאין היא מודל פשוט של ניסיון הקוקאין שימושי בחקר המנגנונים של התמכרות לסמים. במודל נרחב למד את זה לרגישות לטווח ארוכה הנגרמת על ידי חשיפה כרונית לסמים של התעללות, מכרסמים הם מורגלים ראשון לזריקות מלוחים (intraperitoneal; IP) בסביבת רומן (קאמרי שדה פתוח שבו הפעילות של התנועה שלהם היא פיקוח) ; לאחר מכן, הם מקבלים זריקות יומיות של קוקאין בתאי השטח הפתוחים בזמן שהפעילות שלהם היא פיקוח ¹⁰ (איור 1). הפרדיגמה התנהגות זו בדרך כלל תוצאות ברגישות חזקה של התנהגות של תנועה (8-12 לקפל מעל הפעילות בסיסית) ^11, שנשמרה לתקופה של חודשים לאחר הפסקת זריקות קוקאין, הממחישה את היווצרות הקודםעקבות זיכרון asive ניסיון סמים.

המעגלים העצביים של גמול, מעורבים באופן טבעי בחיזוק התנהגויות חיוניות להצלחה של מינים (למשל האכלה, מין), מנוצלים על ידי סמים של התעללות לחזק התנהגויות הקשורים לסמים ^12,13. מופיעים מנגנונים המולקולריים ותאיים על ידי אשר הניסיון של תרופות של התעללות מוגברת להיות דומה למנגנונים העומדים בבסיס ההיווצרות של זכרונות הצהרתיים או סמנטיים במבנים אחרים במוח ^14. לכן, על חוסנו של מודל רגישות ההתנהגות הופך אותו למערכת מודל אטרקטיבית ללמוד מנגנונים של פלסטיות ניסיון תלוי.

הגרעין הנסמך (NAC) הוא אינטגרטור של מעגלי הגמול של המוח מרכזי, ונקשר בהרחבה בהתפתחות של התמכרות ^5,6. ההיווצרות של התמכרות תלויה בשעתוק של חלבונים חדשים בגרעין הנסמך, וחזק בduction של תוכניות שעתוק מובנים באופן ברור הוא ציין בNAC הבא ניסיון קוקאין ^15-19. תגובת תעתיק החריפה לחשיפה לקוקאין עשויה לתפקד במספר הרמות על מנת להתאים לגירוי האינדוקציה החזק ולכוון את הייצור של חלבונים חדשים ש הם אחראים לשינויים המבניים ואלקטרו הנגרמים על ידי חשיפה לתרופה ^6,19-22.

על מנת לקדם את המחקר של מנגנונים מולקולריים של פלסטיות ניסיון תלוי במוח, פרוטוקול מתואר לניתוח המקיף של דינמיקת שעתוק בדגימות רקמת מוח בעקבות מניפולציה התנהגותית. הפרוטוקול בא לידי ביטוי בהקשר של הניסיון התנהגותי למד במעבדה Citri – רגישות התנהגות לקוקאין, תוך ניצול מערכים דינמיים microfluidic לניתוח תעתיק. הפרוטוקול המתואר הוא כמובן לא מוגבל ללימוד tהוא הגרעין נסמך בהקשר של רגישות התנהגות, אבל יכול להיות מיושם על מספר גדול של פרדיגמות התנהגות ואזורים במוח. למעשה, פרוטוקול זה יכול להיות מיושם על רקמות גוף מחוץ למוח, ומגוון רחב של חוויות או מניפולציות של האורגניזם למד.

הפרוטוקול מחולק באופן גס לארבעה שלבים. בשלב הראשון, בעלי החיים כפופים לפרדיגמה ההתנהגות; בשלב השני הרקמה היא microdissected; בשלב השלישי – mRNA הוא, הפוך עיבד מטוהר ומשש, ובשלב האחרון את הנתונים מנותחים.

בהקשר של לימוד דינמיקת תעתיק, העיתוי וההגדרה המדויקים של החוויה הם כנראה פרמטרים הניסיוניים החשובים ביותר כדי לשלוט. מסיבה זו, מודל ההתנהגות שלנו על פי בחירה הוא של רגישות התנהגות לקוקאין, מערכת המאפשרת רמה גבוהה של שליטת הנסיין על הפרמטרים של experience. פרדיגמות התנהגות נוספות המאפשרות תזמון מדויק ולטפל בדגמים שונים של פלסטיות ניסיון תלוי או היווצרות זיכרון זמינות. מודלים אלה כוללים מיזוג פחד ^23, העשרה סביבתית חריפה ^24,25, חיפושי אובייקט רומן ²⁶ וחוויה חזותית הבא גידול כהה ^27. ובכל זאת, רגישות התנהגות לקוקאין היא מניפולציה התנהגותית חזקה באופן עקבי, יוצר עקבות זיכרון נפוצות מאוד שנמשכות חודשים הבאים ניסיון קוקאין ^28.

המוח מחולק, ואחריו microdissection הידני של הגרעין נסמך. זה היה הניסיון שלנו שmicrodissection הידני מפרוסות המוח שהוכנו במהירות מספק את השיטה אמינה והמהירה ביותר של חילוץ הרקמות רלוונטיות לפרדיגמה ההתנהגות, ועם ניסיון, לגבולות הרקמה להיות ברורים וללא קושי מוכר. לחלופין, פרוסות דקות יכולות להיות הכנהed, ואחריו microdissection לייזר ללכוד. אמנם שיטה זו מאפשרת מאוד מוגדרת תיחום של האזור של עניין, הוא איטי (ובכך מסכן את ההפסד של mRNA יציב), מייגע ודורש ציוד ייעודי יקר (מצויד בהתקנת לייזר ללכוד מיקרוסקופ). הפרוטוקול המוגדר במסמך זה גם יכול להיות מותאם לניתוח תעתיק מתא בודד, על ידי שאיפה ידנית של הציטופלסמה של תאים מזוהים ויזואלית באמצעות טפטפות תיקון ^29. חשוב לציין כי הפרוטוקול המתואר מספק ממוצע אוכלוסייה, בזמן שהוא סביר מאוד כי ברוב המקרים, רק תת אוכלוסיות של התאים בתוך הרקמה למעשה מעורבות במתן מענה לחוויה. זה עניין לפרופיל שעתוק באופן סלקטיבי מתוך אוכלוסיות תאים ספציפיות בתגובה לניסיון, אבל דיון בגישות אלה הוא מעבר להיקף הנוכחי.

לטיהור mRNA, הפוך שעתוק ושאילתות qPCR, הרקמהמופר על ידי העברתו דרך מחטים דקות, ואחריו את הניצול של ערכות זמינות מסחרי (למידע נוסף, ראה לוח 8). הבחירה הוא הודיע ​​על ידי ניסיון עם מתודולוגיות אלה, המבטיחים מיצוי אמין של RNA באיכות גבוהה ותוצאות חזקות מיישומים במורד הזרם.

בעוד הפרוטוקול מתואר לתפוקה גבוהה qPCR ניצול מערכים דינמיים, יכולות להיות נחקרות דוגמאות לביטוי גנים באמצעות נקודת סיום PCR, qPCR נמוך תפוקה, microarrays ביטוי גנים או רצף עמוק. ההעדפה לqPCR תפוקה גבוהה תוך ניצול מערכים דינמיים היא בשל העובדה כי mRNA המתקבל מגרעיני המוח הבאים פרדיגמות התנהגות הוא לעתים קרובות כמויות מגבילות. מערכים דינמיים מספקים פלטפורמה המאפשרת ניתוח מקיף יעיל של תמלילים ממספר גדול של דגימות במקביל בניסוי אחד. לאחר הרכישה הראשונית של מערכת microfluidic (נפוץ pu מוסדיrchase), ניסויים זולים יחסית להפעלה. בעקבות ניתוח זה, שאילתא נוספת של הדגימות יכולה להתבצע באמצעות פלטפורמות יקרות יותר כדי לחפש תעתיקי רומן (על ידי microarrays או RNAseq) עם המערכים הדינמיים מתן התייחסות מקיפה לאבטחת איכות. לבסוף, לניתוח נתונים, גישות סטנדרטיים מנוצלות. מצביעים ספציפיים לגבי בעיות שעלולות להתעורר יידונו בטקסט של הפרוטוקול.

פרוטוקול זה הוא מתאים ביותר לחוקרים המעוניינים בחקירה יסודית של מערכת עניין שלהם, כדי לחקור את התנאים ומשכפל מרובים. הפרוטוקול הוא גם מתאים ביותר לחוקרים שכבר מושחז ב( באמצעות ניסויי microarray או RNAseq) על קבוצת משנה של 50-500 הגנים של עניין, שבו הם מעוניינים בביצוע שאילתות שוב ושוב.

Protocol

הערה: הפרוטוקול כדלקמן הנחיות טיפול בבעלי החיים של אוניברסיטת עברית בירושלים. .1 הכנת פתרון ACSF הכן פתרון ACSF כפי שמתואר בטבלה 1. הפוך L 1 DDH 2 O (> 18 MΩ טוהר), מביא osmolarity ל~ …

Representative Results

איכות התוצאות שהתקבלו על ידי יישום פרוטוקול זה מכריע תלוי במספר הפרמטרים. תכנון ניסוי נכון יביא להפרעה מינימאלית לעכברי ניסוי, כך שהניסיון שנבדק (בדוגמא זו, שחשיפה לקוקאין) תהיה החוויה הדומיננטית ביותר בהיסטוריה המודרנית שלהם, ולכן תגרום לתעתיק חזק וספציפי תכנית. <str…

Discussion

אפיון מוצלח של ביטוי גנים מרקמת המוח הבא פרדיגמות התנהגות תלוי: 1) טיפול זהיר של עכברים במהלך הפרדיגמה ההתנהגות; 2) לנתיחה מהירה ומדויקת של רקמה של עניין; 3) אמצעי RNA-בטוח כדי להבטיח את התקינות של רנ"א; ו4) תכנון זהיר של פריימרים ופריסה ניסיונית כמו גם דיוק ותשומת לב לפר?…

Materials

Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGENE	73404
QIAshredder	QIAGENE	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogene	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogene	1355656
Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm)	Self assembled
Inner Perspex box (30X30cm)	Self assembled
camera and video recorder	Campden Inst	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Sagital Brain slicer with a 0.5mm section	Brain Tree Scientific	BS-AL-505S
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspun spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96