Analisi completa di Trascrizione Dynamics da campioni di cervello seguito Behavioral Experience
Summary
This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.
Abstract
La codifica delle esperienze nel cervello e il consolidamento della memoria a lungo termine dipendono dalla trascrizione genica. Identificare la funzione di geni specifici in un'esperienza di codifica è uno dei principali obiettivi delle neuroscienze molecolare. Inoltre, l'associazione funzionale di geni definiti con comportamenti specifici ha implicazioni per la comprensione base dei disturbi neuropsichiatrici. Induzione di programmi di trascrizione robusti è stato osservato nel cervello dei topi seguenti varie manipolazioni comportamentali. Mentre alcuni elementi genetici sono utilizzati ripetutamente seguendo diverse manipolazioni comportamentali e in diversi nuclei cerebrali, programmi trascrizionali sono complessivamente unica agli stimoli che inducono e la struttura in cui sono studiati 1,2.
In questa pubblicazione, un protocollo è descritto per robusta e completa profilatura trascrizionale da nuclei cerebrali di topi in risposta alla manipolazione comportamentale. Ilprotocollo è dimostrata nel contesto di analisi delle dinamiche di espressione genica nel nucleo accumbens seguente esperienza cocaina acuta. A seguito di un definito nell'esperienza vivo, il tessuto neurale bersaglio è sezionato; seguita da purificazione dell'RNA, trascrizione inversa e l'utilizzo di array microfluidica per l'esauriente analisi qPCR di molteplici geni bersaglio. Questo protocollo è orientato verso un'analisi completa (indirizzamento 50-500 geni) di limitare le quantità di materiale di partenza, come ad esempio piccoli campioni di cervello o anche singole cellule.
Il protocollo è più vantaggiosa per l'analisi in parallelo di più campioni (ad esempio, singole cellule, analisi dinamica seguendo farmaceutica, virale o perturbazioni comportamentali). Tuttavia, il protocollo potrebbe anche servire per la caratterizzazione e garanzia di qualità dei campioni prima di studi intero genoma da microarray o RNAseq, nonché la validazione dei dati ottenuti da studi intero genoma.
Introduction
Organizzazione dinamica del cervello permette flessibilità cognitiva e comportamentale. Esperienze sono codificati mediante modifiche della struttura e la forza delle connessioni tra i neuroni nel cervello 3. Questa "plasticità esperienza-dipendente" è il risultato di induzione di specifici pattern di espressione genica che fornisce le proteine necessarie per la modifica della struttura sinaptica e forza 4. L'identificazione di reti di regolazione genica mediare la formazione della memoria a lungo termine è un principio centrale della neuroscienza molecolare, con l'aspettativa che l'identificazione degli elementi dominanti di programmi trascrizionali sarà approfondire la conoscenza dei principi fondamentali che regolano la formazione della memoria, così come obiettivi per trattamento dei neurodegenerative e disturbi neuropsichiatrici. Programmi di trascrizione si svolgono in onde temporalmente definiti, ognuno dei quali codificano geni di carattere diverso, che sono importanti per dfasi ifferent in attuazione dei risultati della manifestazione di segnalazione 1,2. È quindi importante affrontare dinamiche trascrizionali su una scala temporale temporale dettagliata, in modo da identificare la serie completa di geni indotti, e ottenere informazioni sui loro funzione potenziale secondo la dinamica del loro induzione.
La tossicodipendenza è una forma solida di plasticità esperienza-dipendente causata dagli effetti di lunga durata delle sostanze d'abuso sui circuiti neurali nel cervello 5,6. L'esposizione iniziale, acuta ai farmaci può portare allo sviluppo di dipendenza e la transizione verso l'uso cronico. Informazione contestuale è un elemento cruciale nello sviluppo della dipendenza. Stimoli ambientali Drug-associati vengono assegnati notevole importanza nella mente dei tossicodipendenti. Informazioni contestuali ricordando un tossicodipendente di esperienza con la droga passato può indurre ricaduta al craving anche dopo lunghi periodi di astinenza da esposizione al farmaco 7,8.Di qui la grande sfida clinica nella dipendenza – la propensione dei tossicodipendenti della ricaduta anche molto tempo dopo che i sintomi di astinenza sono calmati 9.
Sensibilizzazione comportamentale alla cocaina è un semplice modello di esperienza cocaina utile nello studio dei meccanismi di tossicodipendenza. In questo modello ampiamente studiato per la sensibilizzazione di lunga durata indotta da esposizione cronica a sostanze d'abuso, roditori sono abituati prima a iniezioni di soluzione salina (intraperitoneale; IP) in un ambiente romanzo (una camera campo aperto in cui viene monitorata la loro attività locomotoria) ; poi, ricevono iniezioni giornaliere di cocaina nelle camere a campo aperto mentre la loro attività viene monitorata 10 (Figura 1). Questo paradigma comportamentale si traduce in genere in un robusto sensibilizzazione del comportamento locomotorio (8-12 volte superiori l'attività di base) 11, che viene mantenuto per un periodo di mesi dopo la cessazione delle iniezioni di cocaina, dimostrando la formazione di un pervtraccia di memoria asive di esperienza con la droga.
I circuiti neurali di ricompensa, naturalmente coinvolta nel rafforzare comportamenti essenziali per il successo di una specie (ad esempio, l'alimentazione, il sesso), viene sfruttata da sostanze d'abuso di rinforzare i comportamenti-droga associata 12,13. I meccanismi molecolari e cellulari con cui l'esperienza delle droghe d'abuso è esaltata sembrano essere simili ai meccanismi alla base della formazione dei ricordi dichiarativi o semantiche in altre strutture cerebrali 14. Pertanto, la robustezza del modello comportamentale di sensibilizzazione rende un sistema modello interessante per studiare i meccanismi di plasticità esperienza-dipendente.
Il nucleus accumbens (NAC) è un integratore centrale dei circuiti di ricompensa del cervello, ed è stato ampiamente associato con lo sviluppo di dipendenza 5,6. La formazione di dipendenza dipende trascrizione di nuove proteine nel nucleo accumbens e robustaproduzione di programmi di trascrizione chiaramente strutturati si osserva nel NAc seguente esperienza cocaina 15-19. La risposta trascrizionale acuta all'esposizione cocaina è probabile per funzionare a più livelli per adattarsi alla forte stimolo induzione e per dirigere la produzione di nuove proteine che sono responsabili per i cambiamenti strutturali ed elettrofisiologiche indotte da esposizione al farmaco 6,19-22.
Al fine di promuovere lo studio dei meccanismi molecolari della plasticità esperienza-dipendente nel cervello, un protocollo è descritto per l'analisi completa della dinamica di trascrizione in campioni di tessuto cerebrale a seguito di manipolazione comportamentale. Il protocollo è illustrato nel contesto dell'esperienza comportamentale studiata in laboratorio Citri – sensibilizzazione comportamentale alla cocaina, utilizzando matrici dinamiche microfluidici per analisi trascrizionale. Il protocollo descritto non è ovviamente limitato a studiare tegli nucleo accumbens nel contesto della sensibilizzazione comportamentale, ma potrebbe essere applicata ad un gran numero di paradigmi comportamentali e regioni del cervello. In realtà, questo protocollo potrebbe essere applicato a tessuti del corpo al di fuori del cervello, e una varietà di esperienze o manipolazioni dell'organismo studiato.
Il protocollo è divisa in quattro fasi. Nella prima fase, l'animale è sottoposto al paradigma comportamentale; nella seconda fase il tessuto è microdissezione; nella terza fase – mRNA viene purificato, retrotrascritto e sondato, e nella fase finale i dati vengono analizzati.
Nel contesto di studiare le dinamiche trascrizionali, la tempistica precisa e definizione di esperienza sono probabilmente i più importanti parametri sperimentali per il controllo. Per questo motivo, il nostro modello comportamentale di scelta è quella di sensibilizzazione comportamentale alla cocaina, un sistema che permette elevato livello di controllo sperimentatore sui parametri del experience. Paradigmi comportamentali aggiuntivi che consentono tempi precisi e affrontano diversi modelli di plasticità esperienza-dipendente o di formazione della memoria sono disponibili. Questi modelli includono paura condizionata 23, arricchimento ambientale acuta 24,25, romanzo esplorazione oggetto 26 e l'esperienza visiva in seguito allevamento buio 27. Eppure, sensibilizzazione comportamentale alla cocaina è una manipolazione comportamentale costantemente robusta, creando una traccia di memoria altamente pervasivo che dura da mesi successivi esperienza cocaina 28.
Il cervello è sezionato, seguita da microdissezione manuale nucleo accumbens. E 'stata la nostra esperienza che microdissezione manuale da fettine di cervello rapidamente preparati fornisce il metodo più affidabile e rapida estrazione del tessuto relativo al paradigma comportamentale, e con l'esperienza, i confini del tessuto diventato evidente e facilmente riconoscibile. In alternativa, fette sottili potrebbero essere preparEd, seguito da laser-capture microdissezione. Anche se questo metodo consente altamente definito delineazione della regione di interesse, è lento (rischiando così la perdita di mRNA labile), noioso e richiede costose attrezzature dedicate (un microscopio dotato di una messa a punto laser-capture). Il protocollo qui definita potrebbe anche essere adattato a cella singola analisi trascrizionale, mediante aspirazione manuale del citoplasma delle cellule individuati visivamente utilizzando pipette di patch 29. È importante notare che il protocollo descritto fornisce una media della popolazione, mentre è altamente probabile che nella maggior parte dei casi, solo una sottopopolazione di cellule all'interno del tessuto sono effettivamente coinvolti nella risposta all'esperienza. E 'di interesse al profilo trascrizione in maniera selettiva all'interno di specifiche popolazioni cellulari che rispondono all'esperienza, ma la discussione di questi approcci è oltre l'ambito corrente.
Per la purificazione di mRNA, reverse-trascrizione e qPCR interrogazione, il tessutoè interrotta da passare attraverso aghi sottili, seguita da l'utilizzo di kit disponibili in commercio (per ulteriori informazioni, vedere Tabella 8). La scelta è informato da esperienza con queste metodologie, che garantiscono l'estrazione affidabile di RNA di alta qualità e robusti risultati di applicazioni a valle.
Mentre il protocollo è descritto per high-throughput qPCR utilizzando array dinamici, i campioni possono essere sondati per l'espressione genica utilizzando end-point PCR, a bassa velocità qPCR, gene microarray di espressione o di sequenziamento profondo. La preferenza per high throughput qPCR utilizzando matrici dinamiche è dovuto al fatto che il mRNA ottenuto da nuclei cerebrali seguente paradigmi comportamentali è spesso di quantità limitanti. Gli array dinamici forniscono una piattaforma che consente efficiente un'analisi completa dei trascritti da un gran numero di campioni in parallelo in un singolo esperimento. Dopo l'acquisizione iniziale del sistema microfluidica (comunemente un pu istituzionalerchase), gli esperimenti sono relativamente poco costoso per funzionare. A seguito di questa analisi, un'ulteriore interrogazione dei campioni può essere eseguita utilizzando piattaforme più costose per la ricerca di nuove trascrizioni (di microarrays o RNAseq) con gli array dinamici fornendo un riferimento completo per la garanzia della qualità. Infine, per l'analisi dei dati, approcci standard sono utilizzati. Indicazioni specifiche riguardanti questioni che potrebbero sorgere saranno discusse nel testo del protocollo.
Questo protocollo è più appropriato per i ricercatori interessati a un'indagine approfondita del loro sistema di interesse, studiando più condizioni e replicati. Il protocollo è più adatto per gli investigatori che hanno già affinato in (attraverso microarray o RNAseq esperimenti) su un sottoinsieme di 50-500 geni di interesse, che sono interessati a interrogare ripetutamente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Caratterizzazione di successo di espressione genica da tessuto cerebrale a seguito paradigmi comportamentali dipende da: 1) la gestione attenta dei topi durante il paradigma comportamentale; 2) dissezione rapida e precisa del tessuto di interesse; 3) misure di RNA-safe per assicurare l'integrità dell'RNA; e 4) Un'attenta pianificazione di primer e il layout sperimentale, così come la precisione e l'attenzione al dettaglio nella preparazione per l'analisi qPCR.
Lo scopo …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work has been funded by the Israel Science Foundation Grant (ISF # 393/12), Israel Centers of Research Excellence Grant (I-CORE 1796/12), German-Israel Foundation Grant (GIF # 2299-2291.1/2011) and the Marie Curie Career Integration Grant (FP7-PEOPLE-2013-CIG #618201). Initial steps in the project were funded by an AXA postdoctoral fellowship to AC. We acknowledge the generous startup funds provided by the Edmond and Lily Safra Center for Brain Sciences.
Critical reading by members of the Citri lab is greatly appreciated.
Materials
| Virusol | Oriek Medical | J29D | |
| Isoflurane, USP 100% | MINRAD INC | NDC 60307-110-25 | |
| RNeasy plus Universal Mini Kit | QIAGENE | 73404 | |
| QIAshredder | QIAGENE | 79654 | |
| High Capacity cDNA Reverse Transcription kit | Invitrogene | AB-4368814 | |
| TE Buffer | Invitrogene | 1355656 | |
| Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm) | Self assembled | ||
| Inner Perspex box (30X30cm) | Self assembled | ||
| camera and video recorder | Campden Inst | CMD-80051 | |
| Media Recorder software | Noldus | NDS-NMR3-00M | |
| Iris Scissors | FST | FST-14062-09 | |
| Sagital Brain slicer with a 0.5mm section | Brain Tree Scientific | BS-AL-505S | |
| Bioanalyzer | Agilent Technologies | The Agilent 2100 Bioanalyzer | |
| Thermal cycler | Bio-Rad | 1852048 | |
| Inverted microspun spatula | Bochem Instrument GmbH | 3213 | |
| Biomark HD Reader | Fluidigm | BMHD-BMKHD | |
| Dynamic array Chip for 96.96gene expression | Fluidigm | BMK-M-96.96 |
References
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