Omfattende analyse av transkripsjon Dynamics fra Brain Samples Etter Behavioral Experience

Summary

This manuscript describes a protocol that applies comprehensive profiling for analysis of transcriptional programs induced in specific brain nuclei of rodents following behavioral paradigms. Herein, this approach is illustrated in the context of profiling genes induced in the nucleus accumbens (NAc) of mice following acute cocaine exposure, utilizing microfluidic qPCR arrays.

Abstract

Kodingen av opplevelser i hjernen og konsolideringen av langsiktige minner avhenge gentranskripsjon. Identifisere funksjon av spesifikke gener i koding erfaring er en av de viktigste målene for molekylær nevrovitenskap. Videre funksjonell sammenslutning av definerte gener med spesiell oppførsel har implikasjoner for å forstå grunnlaget for nevropsykiatriske lidelser. Induksjon av robuste transkripsjonsprogrammer har blitt observert i hjernen hos mus etter ulike atferds manipulasjoner. Mens noen genetiske elementer benyttes gjentatte følgende forskjellige adferdsmessige manipulasjoner og i forskjellige hjernekjerner, transkripsjonelle programmer er samlet unike for induserende stimuli og strukturen i hvilket de er studert ^1,2.

I denne publikasjonen er en protokoll som er beskrevet for robust og omfattende transcriptional profilering fra hjerne kjerner av mus i respons til adferds manipulasjon. DenProtokollen er vist i sammenheng med analyse av genekspresjon dynamikk i nucleus accumbens etter akutt kokain erfaring. Etter en definert in vivo erfaring, målet neural vev dissekeres; etterfulgt av RNA-rensing, revers transkripsjon og utnyttelse av microfluidic arrays for omfattende qPCR analyse av flere mål gener. Denne protokollen er rettet mot omfattende analyse (adressering 50-500 gener) av begrensende mengder av utgangsmaterialet, slik som små hjerneprøver eller enkeltceller.

Protokollen er mest fordelaktig for parallell analyse av flere prøver (f.eks enkeltceller, dynamisk analyse følgende farmasøytiske, viral eller adferdsmessige forstyrrelser). Imidlertid kan protokollen også tjene for karakterisering og kvalitetssikring av prøvene før hel-genom studier av mikromatriser eller RNAseq, samt kontroll av data innhentet fra hel-genom studier.

Introduction

Hjernens dynamisk organisasjon muliggjør kognitive og atferdsmessige fleksibilitet. Erfaringer er kodet gjennom modifikasjoner av strukturen og styrke forbindelsene mellom nevroner i hjernen ^tre. Denne "erfaring avhengig plastisitet" er et resultat av induksjon av spesifikke mønstre av genekspresjon som gir de nødvendige proteiner for modifisering av synaptiske struktur og styrke ^4. Identifiseringen av genet regulatoriske nettverk medier dannelsen av langtidshukommelse er en grunnstein i molekylær nevrovitenskap, med forventning om at identifiseringen av de dominerende elementene av transkripsjonsprogrammer vil gi innsikt i de grunnleggende prinsippene som regulerer minne formasjon, samt mål for behandling av neurodegenerative og nevropsykiatriske lidelser. Transkripsjonelle programmer utfolde seg i timelig definerte bølger, hvor hver av disse koder gener som er av forskjellig karakter, som er viktige for different stadier i gjennomføringen av utfallet av signaleringshendelse ^1,2. Det er derfor viktig å ta transkripsjons dynamikk på en detaljert timetidsskala, slik som å identifisere full bemanning av gener indusert, og få innsikt i deres potensial funksjon i henhold til dynamikken i sin induksjon.

Narkotikaavhengighet er en robust form for erfaring avhengig plastisitet forårsaket av den langvarige effekten av narkotika av misbruk på nevrale kretser i hjernen ^5,6. Initial, akutt eksponering for stoffene kan føre til utvikling av avhengighet og overgang til kronisk bruk. Kontekstuell informasjon er et viktig element i utviklingen av avhengighet. Narkotika forbundet miljømessige signaler er tildelt vesentlig betydning i hodet av rusmisbrukere. Kontekstuell informasjon minner en narkotikamisbruker av tidligere narkotika erfaring kan indusere tilbakefall til narkotika ute selv etter lange perioder med avholdenhet fra narkotika ^7,8.Derav stor klinisk utfordring i avhengighet – tilbøyelighet til narkomane til tilbakefall selv lenge etter at abstinenssymptomer har sunket ^ni.

Behavioral overfølsomhet mot kokain er en enkel modell av kokain erfaring nyttig i studiet av mekanismer for narkotikamisbruk. I dette stadig studert modell for langvarig allergi indusert av kronisk eksponering for narkotika av misbruk, er gnagere først vent seg til saltvann injeksjoner (ip; IP) i en roman miljø (et åpent felt kammer der deres bevegelsesaktiviteten overvåkes) ; da får de daglige injeksjoner av kokain i det åpne feltet kamrene mens deres aktivitet er overvåket ¹⁰ (figur 1). Denne atferds paradigme vanligvis resulterer i en robust sensibilisering av lokomotorisk atferd (8-12 ganger over utgangsaktivitet) ^11, som blir opprettholdt for en periode på måneder etter opphør av kokain injeksjoner, noe som viser dannelsen av en grisasive minne spor av narkotika opplevelse.

Den nevrale kretser av belønning, naturligvis involvert i forsterkende atferd avgjørende for å lykkes med en art (for eksempel fôring, sex), blir utnyttet av narkotika av misbruk å forsterke narkotika assosiert atferd ^12,13. De molekylære og cellulære mekanismer som opplevelsen av narkotika av misbruk er forbedret synes å være lik de mekanismene bak dannelsen av deklarative eller semantiske minner i andre strukturer i hjernen ^14. Derfor robustheten av atferds allergi modellen gjør det til et attraktivt modellsystem for å studere mekanismer erfaring avhengig plastisitet.

Nucleus accumbens (NAC) er en sentral integrator av hjernens belønningskretser, og har blitt grundig assosiert med utvikling av avhengighet ^5,6. Dannelsen av avhengighet avhengig transkripsjon av nye proteiner i nucleus accumbens, og robustduksjon av klart strukturerte transkripsjonsprogrammer er observert i NAC følgende kokain erfaring ^15-19. Den akutte transcriptional respons på kokain eksponering forventes å fungere på flere nivåer for å tilpasse seg den sterke induksjon stimulans og for å lede produksjonen av nye proteiner som er ansvarlige for de strukturelle og elektrofysiologiske endringer indusert ved eksponering for medikamentet ^6,19-22.

For å fremme studiet av molekylære mekanismer erfaring avhengig plastisitet i hjernen, er en fremgangsmåte beskrevet for omfattende analyse av transkripsjons dynamikken i hjernen vevsprøver følgende atferds manipulasjon. Protokollen er illustrert i sammenheng med atferds erfaring studert i Citri lab – behavioral overfølsomhet mot kokain, utnytte microfluidic dynamiske arrays for transcriptional analyse. Protokollen er beskrevet er selvsagt ikke begrenset til å studere than nucleus accumbens i sammenheng med atferds allergi, men kan brukes til et stort antall atferds paradigmer og hjerneregioner. Faktisk kan denne protokoll anvendes på kroppsvev utenfor hjernen, og en rekke erfaringer eller manipulasjoner av organismen undersøkt.

Protokollen er grovt sett deles inn i fire trinn. I det første trinnet, blir dyret utsatt for den atferds paradigme; i det andre trinnet i vevet er microdissected; i det tredje trinn – mRNA renset, revers-transkribert og analysert, og i det siste trinnet dataene blir analysert.

I sammenheng med å studere transkripsjons dynamikk, presis timing og definisjon av opplevelsen er trolig de viktigste eksperimentelle parametere for å kontrollere. Av denne grunn er det av atferds sensibilisering til kokain, et system som gir høy grad av experimenter kontroll over parametere til erfarin vår adferdsmodell av valgetce. Andre atferds paradigmer som muliggjør presis timing og adresse forskjellige modeller av erfaring avhengig plastisitet eller minnedannelse er tilgjengelig. Disse modellene inkluderer frykt conditioning ^23, akutt miljøberikelse ^24,25, roman objekt leting ²⁶ og visuell opplevelse følgende mørk oppdragelse ^27. Likevel, atferds overfølsomhet mot kokain er et gjennomgående robust atferds manipulasjon, og skaper en svært gjennomgripende minne spor som varer i måneder etter kokain erfaring ^28.

Hjernen er seksjonert, etterfulgt av manuell microdissection av nucleus accumbens. Det har vært vår erfaring at manuell microdissection fra raskt forberedt hjernen skiver gir den mest pålitelige og rask metode for å utvinne vevet relevant for atferds paradigme, og med erfaring, er grensene for vevet bli tydelig og lett gjenkjent. Alternativt kunne fine skiver være prepared, etterfulgt av laser-fangst microdissection. Selv om denne metoden muliggjør svært definert avgrensning av regionen av interesse, er det sakte (og dermed risikere tap av labilt mRNA), kjedelig og krever kostbare dedikerte utstyr (et mikroskop utstyrt med en laser-fangst setup). Protokollen som definert heri kan også tilpasses encellede transcriptional analyse, ved manuell aspirasjon av cytoplasma visuelt identifiserte cellene ved hjelp av påsydde pipetter ^29. Det er viktig å merke seg at den protokoll som er beskrevet gir en populasjon gjennomsnitt, mens det er meget sannsynlig at i de fleste tilfeller, bare en subpopulasjon av celler i vev faktisk er involvert i å svare på erfaring. Det er av interesse å profilere transkripsjon på en selektiv måte innenfra spesifikke cellepopulasjoner som svarer til opplevelsen, men diskusjon av disse metodene er utover dagens omfang.

For mRNA rensing, reverse-transkripsjon og qPCR spørring, vevetavbrytes ved å føre det gjennom fine nåler, etterfulgt av bruk av kommersielt tilgjengelige kits (for mer informasjon, se tabell 8). Valget er informert av erfaring med disse metodene, som sikrer pålitelig utvinning av høy kvalitet RNA og robuste resultater fra nedstrømsapplikasjoner.

Mens protokollen er beskrevet for høy gjennomstrømming qPCR utnytte dynamiske arrays, kan prøvene analysert for genuttrykk ved hjelp endepunkt PCR, lav gjennomstrømming qPCR, genekspresjon mikromatriser eller dyp-sekvensering. Preferansen for high-throughput qPCR utnytte dynamiske matriser er på grunn av det faktum at mRNA erholdt fra hjernekjerner følgende atferds paradigmer ofte er av begrensende mengder. Dynamiske matriser tilveiebringe en plattform som muliggjør effektiv omfattende analyse av transkripter fra et stort antall av parallelle prøver i et enkelt eksperiment. Etter den første oppkjøpet av mikrofluidsystem (vanligvis en institusjonell purchase), eksperimenter er relativt billig å løpe. Etter denne analysen, kan ytterligere spørring av prøvene utføres med mer kostbare plattformer for å søke etter nye transkripsjoner (ved mikromatriser eller RNAseq) med de dynamiske arrays gir en omfattende referanse for kvalitetssikring. Til slutt, for dataanalyse, er standard tilnærminger utnyttet. Konkrete tips om problemer som kan oppstå vil bli diskutert i teksten i protokollen.

Denne protokollen er mest hensiktsmessig for etterforskerne er interessert i en grundig undersøkelse av deres system av interesse, studere flere forhold og gjentak. Protokollen er også mest egnet for etterforskere som allerede har finslipt i (gjennom microarray eller RNAseq eksperimenter) på en undergruppe av 50-500 gener av interesse, som de er interessert i å spørre flere ganger.

Protocol

MERK: Protokollen følger retningslinjene til The Hebrew University of Jerusalem dyr omsorg. 1. Utarbeidelse av ACSF Solution Forbered ACSF løsning som beskrevet i tabell 1. Lag 1 L i DDH 2 O (> 18 mÊ renhet), og bringer osmolariteten til ~ 300 mOsm / L med passende tilsetning av vann eller NaCl. 2. Utstyr og rommet satt opp Utstyr for overvåking av kokain-indusert muskel atferd består…

Representative Results

Kvaliteten av resultatene oppnådd ved anvendelse av denne protokollen i avgjørende grad er avhengig av en rekke parametere. Riktig forsøksplanlegging vil resultere i minimal forstyrrelse for de eksperimentelle mus, slik at erfaringen testet (i dette eksempelet, at for eksponering for kokain) vil være den mest dominerende erfaring i sin nyere tid, og derfor vil resultere i en robust og spesifikk transkripsjons program. Figur 1 beskriver den eksperimentelle plan for adferds sensibilisering til kokain,…

Discussion

Vellykket karakterisering av genuttrykk fra hjernevev følgende atferds paradigmer avhengig av: 1) forsiktig håndtering av mus i løpet av atferds paradigmet; 2) Rask og presis disseksjon av vev av interesse; 3) RNA-sikker tiltak for å sikre integriteten av RNA; og 4) Nøye planlegging av primere og eksperimentelle oppsettet samt presisjon og oppmerksomhet på detaljer i forberedelse til qPCR analyse.

Hensikten med den fremgangsmåte som er beskrevet, er å karakterisere dynamikken i trans…

Materials

Virusol	Oriek Medical	J29D
Isoflurane, USP 100%	MINRAD INC	NDC 60307-110-25
RNeasy plus Universal Mini Kit	QIAGENE	73404
QIAshredder	QIAGENE	79654
High Capacity cDNA Reverse Transcription kit	Invitrogene	AB-4368814
TE Buffer	Invitrogene	1355656
Behaviour Chamber (MDF; 50X45cm)	Self assembled
Inner Perspex box (30X30cm)	Self assembled
camera and video recorder	Campden Inst	CMD-80051
Media Recorder software	Noldus	NDS-NMR3-00M
Iris Scissors	FST	FST-14062-09
Sagital Brain slicer with a 0.5mm section	Brain Tree Scientific	BS-AL-505S
Bioanalyzer	Agilent Technologies	The Agilent 2100 Bioanalyzer
Thermal cycler	Bio-Rad	1852048
Inverted microspun spatula	Bochem Instrument GmbH	3213
Biomark HD Reader	Fluidigm	BMHD-BMKHD
Dynamic array Chip for 96.96gene expression	Fluidigm	BMK-M-96.96