Static Adesione saggio per lo Studio della integrina attivazione nei linfociti T
Summary
Saggi di adesione statica è un potente strumento che può essere utilizzato per modellare le interazioni tra linfociti T e altri tipi di cellule. Interazioni sono generati iniettando cellule T etichettati in pozzetti rivestiti con molecole di adesione, mentre un lettore di piastra viene utilizzato per quantificare il numero di cellule aderenti seguente lavaggi seriali.
Abstract
È richiesto T linfociti adesione per molteplici funzioni delle cellule T, compresa la migrazione ai siti di infiammazione e formazione di sinapsi immunologica con cellule presentanti l'antigene. Cellule T compiere adesione regolata controllando le proprietà adesive delle integrine, una classe di molecole di adesione cellulare composti da coppie eterodimeri di proteine transmembrana che interagiscono con le molecole bersaglio sulle cellule partner o matrice extracellulare. Il più importante integrina cellule T è la funzione dei linfociti antigene associato (LFA) -1, composto da subunità αL e β2, il cui obiettivo è la molecola di adesione intracellulare (ICAM) -1. La capacità di una cellula T per controllare adesione deriva dalla capacità di regolare gli stati affinità dei singoli integrine. Inside-out di segnalazione descrive il processo attraverso il quale i segnali all'interno di una cella causano i domini esterni delle integrine ad assumere uno stato attivato. Gran parte della nostra conoscenza di questi fenomeni complessi si basa su meccanicisticastudi effettuati in semplificata de sistemi modello in vitro. Il test dei linfociti T adesione qui descritto è un ottimo strumento che consente alle cellule T di aderire a bersaglio molecole, in condizioni statiche, e poi utilizza un lettore di piastra fluorescente quantificare adesività. Questo test è stato utile per definire sostanze adesione-stimolatorio o inibitorio che agiscono sui linfociti, così come caratterizzare gli eventi di segnalazione coinvolte. Anche se qui descritta per LFA-1 – ICAM-1 di adesione mediata; questo dosaggio può essere facilmente adattato per consentire lo studio di altre interazioni adesive (ad esempio VLA-4 – fibronectina).
Introduction
T linfociti adesione è un processo fondamentale nella risposta immunitaria 1. E 'richiesto per l'interazione delle cellule T con le cellule endoteliali decorare le pareti dei capillari, per antigene scansione cellule presentanti (APC) entro linfonodi, e per la formazione di sinapsi immunologiche (IS) con cellule bersaglio 2. Questi requisiti sono funzionalmente e cineticamente distinti. Il processo di linfociti stravaso si compone di chemiotassi, laminazione, ferma adesione e la trasmigrazione. La transizione dalla laminazione a rassodare adesione richiede cellule T per rispondere a un segnale recettore accoppiato a proteina G rapidamente. Questa risposta produce un'interazione ligando integrina che rallenta e arresti la cella di rotolamento 3. Un cambiamento immediato nel avidità delle integrine media questo processo. La migrazione richiede interazioni betweenTcells dinamici e cellule endoteliali, con la formazione di aderenze al 'front end' e la rottura delle aderenze alla 'coda'con un intervallo di circa un minuto tra formazione e la rottura 4. La IS forma inminutes, ma deve rimanere intatta per ore 6.
È interessante notare che, una molecola di adesione, la funzione dei linfociti membro della famiglia delle integrine antigene associato (LFA) – 1, è essenziale per tutti questi processi 5. LFA-1 media l'adesione attraverso interazioni con diversi membri della superfamiglia delle immunoglobuline. Il ligando più studiato con la più alta affinità di LFA-1 è la molecola di adesione intercellulare (ICAM) -1. Linfociti circolanti non attivati esprimono bassa affinità LFA-1 sulla superficie cellulare, e quindi sono in grado di aderire alle superfici ICAM-1-rivestita. LFA-1 affinità è variabile e regolata da diversi eventi di segnalazione come la proteina recettore accoppiato attivazione G, stimolazione di citochine, e segnali mediati da recettori delle cellule T (TCR). La risultante forma alta affinità di LFA-1 trasmette l'attivazione intracellulare allo spazio extracellulare tttraverso interazioni con ICAM-1. Questo percorso è definito dentro-fuori di segnalazione 7. Analogamente, la segnalazione attraverso LFA-1 dallo spazio extracellulare è chiamato dall'esterno all'interno segnalazione.
Il intracellulare cascate di segnalazione coinvolte nel inside-out e outside-in di segnalazione sono un obiettivo importante della ricerca attuale. La piccola GTPasi Rap1 è recentemente emerso come il componente chiave di inside-out di segnalazione che è comune ad entrambi legatura TCR e citochine segnalazione 8. Il ruolo critico di Rap1 in attivazione integrina è evidenziata dalla scoperta che la sovraespressione di Rap1 stimola integrina-dipendente adesione delle cellule T, mentre l'adesione delle cellule T è bloccato da espressione di dominante Rap1 negative 9. Questi progressi nella nostra comprensione della regolazione integrina da Rap1 sono state compiute utilizzando strumenti in vitro. Tra questi è il saggio adesione statica qui descritto.
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di studiare Tadesività e ICAM-1 superfici rivestite. Più specificamente, viene utilizzato per misurare obiettivamente e quantificare LFA-1 affinità verso i suoi contatore ligandi in cellule vive in tempo reale, in condizioni diverse. Questa tecnica utilizza pozzetti di polistirene rivestite con ICAM-1 per imitare le superfici cellulari che le cellule T interagiscono. Molti saggi di adesione delle cellule T statico precedentemente descritti potessero sperimentalmente complesso. Questi saggi spesso richiesti per le cellule T siano marcati radioattivamente, utilizzate cellule corneali bovina coltivate per creare una matrice extracellulare come substrato per l'adesione delle cellule T, o chiamati per non fisiologica stimolazione delle cellule T durante un periodo prolungato di promuovere l'adesione delle cellule T 10. L'uso di misurazione fluorimetrica quantificare cellule T a seguito dell'incubazione adesione è un metodo più sensibile e preciso di quantificazione rispetto alla citometria a flusso e microscopia, come sono utilizzati in molti altri sistemi di dosaggio 11. Inoltre, microscop singola cellaanalisi ic Geografica integrina non consente l'ampio, popolazione sulla base dell'analisi nello stesso modo come la misurazione fluorimetrica. Mentre LFA-1 anticorpi specifici dello stato di attivazione sono disponibili in commercio, questi anticorpi offrono una bassa sensibilità rispetto al metodo descritto qui. Il principale vantaggio rispetto alle tecniche alternative è la sua semplicità e la capacità di esaminare più condizioni sperimentali contemporaneamente. Quando si considera questo metodo per una specifica applicazione, si dovrà tener conto che le cellule T devono essere selezionati negativamente, appena isolate, e marcate con un marcatore fluorescente.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ci sono diversi saggi per studiare segnali di LFA-1 attivazione e T adesione cellulare 12. Citometria a flusso è utilizzato per misurare la LFA-1 affinità stati nelle cellule viventi utilizzando anticorpi monoclonali che si legano selettivamente a uno piegato o estesa LFA-1. Uno dei limiti di questo metodo è che non tiene conto avidità delle integrine. Saggi di migrazione sono strumenti utili ma che misurano la migrazione, e non l'adesione misero in un dato momento. Modelli murini per studiare la migr…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil Trust, Michael Saperstein medici studiosi fondi di ricerca, e la comunione NYU Whitehead sostenuto questo lavoro.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
- Dustin, M. L., et al. Membranes as messengers in T cell adhesion signaling. Nat Immunol. 5 (4), 363-372 (2004).
- Mor, A., et al. GTPases and LFA-1 reciprocally modulate adhesion and signaling. Immunol Rev. 218, 114-125 (2007).
- Rose, D. M., et al. Integrin modulation and signaling in leukocyte adhesion and migration. Immunol Rev. 218, 126-134 (2007).
- Alon, R., Feigelson, S. W. Chemokine-triggered leukocyte arrest: force-regulated bi-directional integrin activation in quantal adhesive contacts. Curr Opin Cell Biol. 24 (5), 670-676 (2012).
- Griffith, J. W., Luster, A. D. Targeting cells in motion: migrating toward improved therapies. Eur J Immunol. 43 (6), 1430-1435 (2013).
- Dustin, M. L. Cell adhesion molecules and actin cytoskeleton at immune synapses and kinapses. Curr Opin Cell Biol. 19 (5), 529-533 (2007).
- Springer, T. A., Dustin, M. L. Integrin inside-out signaling and the immunological synapse. Curr Opin Cell Biol. 24 (1), 107-115 (2012).
- Mor, A., et al. D1 regulates lymphocyte adhesion via upregulation of Rap1 at the plasma membrane. Mol Cell Biol. 29 (12), 3297-3306 (2009).
- Bivona, T. G., et al. Rap1 up-regulation and activation on plasma membrane regulates T cell adhesion. J Cell Biol. 164 (3), 461-470 (2004).
- Zeltzer, E., et al. Diminished adhesion of CD4+ T cells from dialysis patients to extracellular matrix and its components fibronectin and laminin. Nephrol Dial Transplant. 12 (12), 2618-2622 (1997).
- Bhattacharyya, S. P., et al. Both adhesion to immobilized vitronectin and Fc epsilon RI cross-linking cause enhanced focal adhesion kinase phosphorylation in murine mast cells. Immunology. 98 (3), 357-362 (1999).
- Dustin, M. L., Groves, J. T. Receptor signaling clusters in the immune synapse. Annu Rev Biophys. 41, 543-556 (2012).
