Statique Essai d'adhésion pour l'étude de l'intégrine activation dans les lymphocytes T
Summary
Analyse de l'adhérence statique est un outil puissant qui peut être utilisé pour modéliser les interactions entre les lymphocytes T et d'autres types cellulaires. Les interactions sont générées par l'injection de cellules T marquées dans des puits revêtus de molécules d'adhérence, tandis que un lecteur de plaque est utilisée pour quantifier le nombre de cellules adhérentes suivant lavages en série.
Abstract
L'adhérence des lymphocytes T sont nécessaires pour de multiples fonctions de cellules T, y compris la migration vers les sites d'inflammation et la formation de synapses immunologiques avec des cellules présentatrices d'antigène. Les cellules T accomplir adhérence régulée en contrôlant les propriétés adhésives des intégrines, une classe de molécules d'adhésion cellulaire hétérodimères constitués de paires de protéines transmembranaires qui interagissent avec les molécules cibles sur des cellules ou des partenaires de la matrice extracellulaire. L'intégrine la plus importante des cellules T est la fonction lymphocytaire antigène associé (LFA) -1, composé de sous-unités β2 et aL, dont la cible est la molécule d'adhésion intracellulaire (ICAM) -1. La capacité d'une cellule T pour contrôler l'adhérence provient de la capacité à réguler les états d'affinité des intégrines individuelles. Signalisation inside-out décrit le processus par lequel des signaux à l'intérieur d'une cellule provoquent les domaines externes de intégrines à assumer un état activé. Une grande partie de notre connaissance de ces phénomènes complexes est basée sur mécanisteDes études effectuées dans simplifiée dans des systèmes de modèles in vitro. Le test d'adhésion des lymphocytes T décrit ici est un excellent outil qui permet aux cellules T à adhérer à des molécules cibles, dans des conditions statiques, puis utilise un lecteur de plaque fluorescente de quantifier l'adhérence. Ce dosage a été utile dans la définition de l'adhérence des substances stimulant ou inhibiteur qui agissent sur les lymphocytes, ainsi que la caractérisation des événements de signalisation impliquées. Bien que décrit ici pour LFA-1 – ICAM-1 médiée adhérence; ce dosage peut être facilement adapté pour permettre l'étude d'autres interactions adhésives (par exemple, VLA-4 – fibronectine).
Introduction
L'adhérence des lymphocytes T est un processus fondamental dans la réponse immunitaire 1. Il est nécessaire pour l'interaction des lymphocytes T avec les cellules endothéliales décorer les parois capillaires, pour l'antigène des cellules présentatrices de balayage (APC) à l'intérieur des ganglions lymphatiques, et pour la formation de synapses immunologiques (IS) avec des cellules cibles 2. Ces exigences sont fonctionnellement distincte et cinétique. Le processus de lymphocytes extravasation se compose de la chimio-attraction, roulement, adhérence ferme et la transmigration. La transition de roulement pour raffermir l'adhérence des lymphocytes T nécessite de répondre à un signal de récepteur couplé à la protéine G rapidement. Cette réponse donne une interaction ligand des intégrines qui ralentit et arrête la cellule de roulement 3. Un changement immédiat dans avidité intégrine médiatise ce processus. Migration nécessite interactions betweenTcells dynamiques et les cellules endothéliales avec la formation d'adhérences à l'extrémité avant »et la rupture des adhérences à l'extrémité arrière 'avec un intervalle d'environ une minute entre la formation et la rupture 4. L'IS forme inminutes, mais doit rester intact pendant des heures 6.
Fait intéressant, une molécule d'adhérence, la fonction des lymphocytes membre de la famille des intégrines antigène associé (LFA) – 1, est essentiel pour tous ces processus 5. LFA-1 médie l'adhésion grâce à des interactions avec plusieurs membres de la superfamille des immunoglobulines. Le ligand le plus largement étudié avec la plus forte affinité pour le LFA-1 est la molécule d'adhésion intercellulaire (ICAM) -1. Lymphocytes circulants non activés expriment une faible affinité de LFA-1 sur la surface cellulaire, et par conséquent ne peuvent pas adhérer à des surfaces ICAM-1-enduit. LFA-1, l'affinité est variable et régulée par plusieurs événements de signalisation telles que la protéine G couplée activation du récepteur, la stimulation de cytokines, et des signaux médiés par des récepteurs de cellules T (TCR). L'forme de haute affinité résultant de LFA-1 transmet activation intracellulaire vers l'espace extracellulaire trâce interactions avec ICAM-1. Cette voie est appelée inside-out signalisation 7. De même, la signalisation par LFA-1 de l'espace extracellulaire est appelé en dehors dans la signalisation.
Le intracellulaire cascades impliqués dans l'envers et à l'extérieur dans la signalisation de signalisation sont un axe majeur de la recherche actuelle. La petite GTPase Rap1 a récemment émergé comme l'élément clé de l'intérieur-out signalisation qui est commun aux deux ligature TCR et de signalisation 8 cytokine. Le rôle essentiel des Rap1 dans l'activation des intégrines est mis en évidence par la découverte que la surexpression de Rap1 stimule l'adhérence de l'intégrine-dépendant des cellules T, tandis que l'adhésion des cellules T est bloqué par l'expression d'Rap1 dominant négatif 9. Ces avancées dans notre compréhension de la régulation de l'intégrine par Rap1 ont été réalisées en utilisant des outils in vitro. Parmi eux se trouve l'analyse de l'adhérence statique décrit ici.
L'objectif global de cette méthode est d'étudier Tcellule adhérence à ICAM-1 des surfaces revêtues. Plus précisément, il est utilisé pour mesurer objectivement et quantifier l'affinité de LFA-1 vers ses homologues de ligands dans les cellules vivantes au temps réel, dans différentes conditions. Cette technique utilise des puits de polystyrène revêtus d'ICAM-1 pour imiter les surfaces cellulaires que les cellules T interagissent avec. De nombreux tests d'adhésion sur les cellules T ont été décrites précédemment statique expérimentalement complexe. Ces dosages souvent requis pour les cellules T à être marquées de façon radioactive, utilisés cellules cornéennes bovines en culture pour créer une matrice extracellulaire comme substrat pour T adhésion cellulaire, ou appelé à la stimulation des cellules T non-physiologique pendant une durée prolongée, de promouvoir T adhésion cellulaire 10. L'utilisation de la mesure fluorométrique pour quantifier les lymphocytes T suite à l'incubation de l'adhérence est une méthode plus sensible et précise de la quantification par rapport à la cytométrie en flux et la microscopie, qui sont utilisés dans de nombreux autres systèmes de dosage 11. En outre, par microscopie de cellule uniqueic analyse de l'intégrine localisation ne permet pas de la large population sur la base de l'analyse de la même manière que la mesure fluorométrique. Alors que l'activation de LFA-1 anticorps spécifiques de l'Etat sont disponibles dans le commerce, ces anticorps offrent une faible sensibilité par rapport à la méthode décrite ici. Le principal avantage par rapport aux techniques alternatives est sa simplicité et la possibilité d'examiner de multiples conditions expérimentales simultanément. Lors de l'examen de cette méthode pour une application spécifique, il faut prendre en compte que les cellules T doivent être sélectionnés négativement, fraîchement isolées, et marqué avec un marqueur fluorescent.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il existe plusieurs tests pour étudier les signaux de LFA-1 et l'activation T adhésion cellulaire 12. La cytométrie en flux est utilisée pour mesurer LFA-1 affinité Etats dans les cellules vivantes en utilisant des anticorps monoclonaux qui se lient sélectivement soit plié ou étendu LFA-1. Une des limites de cette méthode est qu'elle ne tient pas compte de l'avidité des intégrines. essais de migration sont des outils utiles, mais ils mesurent la migration, et non adhérence maigre à un…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschil Trust, Saperstein Scholars finance la recherche médicale Michael, et la communion NYU Whitehead pris en charge ce travail.
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
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