Tリンパ球におけるインテグリン活性化の研究のための静的な接着アッセイ
Summary
静的接着アッセイは、Tリンパ球および他の細胞型間の相互作用をモデル化するために使用することができる強力なツールである。プレートリーダーは、シリアル回洗浄し、以下の接着細胞の数を定量するために使用される相互作用は、接着分子でコーティングされたウェルに標識されたT細胞を注入することによって生成される。
Abstract
Tリンパ球の接着は、炎症および抗原提示細胞との免疫学的シナプスの形成部位への遊走を含む複数のT細胞機能に必要とされる。 T細胞は、インテグリン、パートナー細胞または細胞外マトリックス上の標的分子と相互作用する膜貫通タンパク質のヘテロ二量体対からなる細胞接着分子のクラスの接着特性を制御することにより調整された接着性を達成する。最も顕著なT細胞は、インテグリンリンパ球機能関連抗原（LFA）-1サブユニットが標的細胞内接着分子（ICAM）-1αLおよびβ2から構成である。接着を制御するためのT細胞の能力は、個々のインテグリンの親和性の状態を調節する能力に由来する。インサイドアウトシグナル伝達は、細胞内のシグナルがインテグリンの外部ドメインが活性化された状態を想定する原因となるプロセスについて説明します。これらの複雑な現象の私たちの知識の多くは、機械論に基づいていますin vitroモデル系で単純化された中で行われた研究。ここで説明するTリンパ球接着アッセイは、T細胞は、静的な条件下で、標的分子に付着させることができ、その後、接着性を定量化するために、蛍光プレートリーダーを利用する優れたツールである。このアッセイは、リンパ球に作用する接着刺激または阻害する物質を定義するだけでなく、関係するシグナル伝達事象を特徴づけるに有用であった。 LFA-1のためにここで説明したが – ICAM-1仲介接着;このアッセイは、容易に他の接着相互作用（ -フィブロネクチン例えば、VLA-4）の研究を可能にするように適合させることができる。
Introduction
Tリンパ球の接着は、免疫応答1と基本的な処理である。これは、標的細胞に2リンパ節内の細胞（APC）に抗原提示を走査するため、および免疫学的シナプスの形成のために、内皮細胞が毛細血管壁を装飾するとT細胞の相互作用のために（IS）が必要である。これらの要件は、機能的にも速度論的に区別される。リンパ球の血管外漏出のプロセスは、化学誘引、ローリング、強固な接着、移住から構成されています。接着を会社にローリングからの移行が急速にGタンパク質共役受容体シグナルに応答するT細胞を必要とします。この応答は、細胞ローリング3を遅くし、逮捕インテグリンリガンド相互作用が得られます。インテグリン結合活性の即時の変化は、このプロセスを仲介する。移行は「フロントエンド」と「後端」の癒着の破損で癒着の形成と動的な相互作用のbetweenTcellsおよび内皮細胞を必要とする形成し、4を壊す約分間隔で。 ISはinminutesを形成するが、時間6用にそのまま残る必要があります。
興味深いことに、ある接着分子、インテグリンファミリーメンバーリンパ球機能関連抗原（LFA） -図1は、これら全ての方法5に必須である。 LFA-1は、免疫グロブリンスーパーファミリーのいくつかのメンバーとの相互作用を介して接着を媒介する。 LFA-1の最も高い親和性を有する最も広く研究リガンドは、細胞間接着分子（ICAM）-1である。非活性循環リンパ球は、細胞表面上に低親和性LFA-1を発現し、従って、ICAM-1でコーティングされた表面に付着することができない。 LFA-1の親和性は、可変ならびにT細胞受容体（TCR）によって媒介されるGタンパク質共役受容体の活性化、サイトカイン刺激、および信号などのいくつかのシグナル伝達事象によって調節される。LFA-1が得られた高親和性形態は、細胞外空間への細胞内活性化を搬送するTICAM-1との相互作用hrough。この経路は、7シグナリングインサイドアウトと呼ばれている。同様に、細胞外の空間から、LFA-1を介したシグナル伝達は、アウトサイド·インのシグナリングと呼ばれています。
インサイドアウトやアウトサイドインシグナル伝達に関与カスケードの細胞内シグナル伝達は、現在の研究の主要な焦点である。低分子量GTPase Rap1のは、最近、それは、TCRライゲーションおよび8サイトカインシグナルの両方に共通しているシグナルインサイドアウトの重要な要素として浮上している。インテグリン活性化のRap1の重要な役割は、T細胞の接着が、ドミナントネガティブ型Rap1 9の発現によって遮断される一方のRap1の過剰発現は、T細胞のインテグリン依存性接着を刺激するという発見により強調される。 Rap1のによるインテグリン規制の我々の理解におけるこれらの進歩は、in vitroのツールで使用して達成されてきた。これらの中でも、ここで説明した静的接着アッセイである。
この方法の全体的な目標は、Tを研究することであるICAM-1をコーティングした表面への細胞接着。具体的には、客観的に測定し、異なる条件下で、リアルタイムで生細胞におけるそのカウンターリガンドに向かってLFA-1の親和性を定量するために使用される。この技術は、T細胞と相互作用する細胞の表面を模倣するようにICAM-1でコーティングしたポリスチレンウェルを使用する。多くの前述の静的T細胞接着アッセイは、実験的に複雑であった。これらのアッセイは、しばしば、培養されたウシ角膜細胞は、T細胞の接着のための基質として細胞外マトリックスを作成するために利用される放射性標識するT細胞に必要な、またはT細胞の接着10を促進するために拡張された期間にわたって非生理学的T細胞刺激を求めた。多くの他のアッセイシステム11で利用されるように、フローサイトメトリーおよび顕微鏡流れと比較して、接着インキュベーション後のT細胞を定量するための蛍光測定の使用は、定量化のより高感度かつ正確な方法である。さらに、単一細胞microscopインテグリン局在のIC分析では、蛍光の測定と同様に広範な、人口ベースの分析のために許可していません。活性化状態特異LFA-1抗体が市販されているが、これらの抗体は、ここで説明する方法に比べて低い感度を提供します。代替技術上の主な利点は、その単純さと、同時に複数の実験条件を確認できることが挙げられます。特定のアプリケーションのためにこの方法を検討する場合、一方はT細胞が負に、選択された新たに単離され、蛍光マーカーで標識されるべきであることを考慮すべきである。
Protocol
Representative Results
Discussion
LFA-1活性化およびT細胞の接着12に信号を研究するためのいくつかのアッセイがある。フローサイトメトリーは、屈曲またはLFA-1の拡張のいずれかに選択的に結合するモノクローナル抗体を用いて生細胞におけるLFA-1の親和性の状態を測定するために使用される。この方法の制限の1つは、それが考慮インテグリン '結合活性をとらないことである。遊走アッセイは、便利なツールです…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Hirschilトラスト、マイケル·セイパースタインメディカル学者研究費、およびニューヨーク大学ホワイトヘッドの交わりは、この作品を支持した。
Materials
| Plate reader | BioTek | Synergy H1 Hybrid | |
| Multichannel pipette | Fisher | 21-377-829 | |
| 96-well microplate with optical bottom | Corning Costar | 3603 | |
| Recombinant ICAM-1 | R&D Systems | ADP4-050 | |
| Anti-CD3 antibodies | Ancell | 144-020 | |
| PMA | Sigma-Aldrich | 79346 | |
| BSA | Sigma-Aldrich | A2058 | |
| CFSE | Molecular Probes | C1157 | |
| RPMI | Gibco | 11875-093 | |
| DPBS containing calcium and magnesium | Gibco | 14190250 | |
| Peripheral lymphocytes | e.g. mouse or human | ||
| Magnesium chloride | Sigma-Aldrich | M8266 | |
| Calcium chloride | Sigma-Aldrich | 499609 | |
| Open Gen 5 software | BioTek | Version 2.01 | |
| Ficoll-Paque PLUS | GE Healthcare | 71-7167-00 | |
| 15 and 50 mL centrifuge tubes | Fisher | 352099, 352070 | |
| Disposable plastic Pasteur pipettes | Fisher | 13-711-7M | |
| T-75 culture flasks | Fisher | 50-754-1366 | |
| RosetteSep T cell enricment kit | StemCell Technologies | 15061 |
References
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