Измерение осмотического коэффициента водопроницаемости (P F) клеток может помочь понять механизмы регулирования аквапоринов (AQPs). Р определение F в сферических протопластов клеток растений, представленных здесь, включает в себя изоляцию протопластов и численный анализ их начальной скорости изменения объема в результате осмотического вызов во время постоянной ванны перфузии.
Изучение механизмов регулирования Aqp имеет решающее значение для понимания водных отношений в оба сотовой и целых уровней растений. Представленные здесь является простым и очень эффективным способом для определения осмотического коэффициента проницаемости воды (Р F) в протопластов растений, в принципе применимо и к другим сферических клеток, таких как лягушки ооцитов. На первом этапе анализа является выделение протопластов из растительной ткани интереса ферментативным расщеплением в камеру с соответствующим изотонического раствора. Второй этап состоит из осмотической вызов теста: протопласты иммобилизованные на дне камеры представляются постоянной перфузии, начиная с изотоническим раствором, а затем гипотонического раствора. Ячейка опухоль видеозаписи. На третьем этапе, изображения обрабатываются сообщение с получением изменения объема, и временной ход изменения объема коррелирует с течением времени изменения osmolaпасности камеры перфузии среды, используя кривую процедуру подгонки написанный на Matlab ('PfFit'), чтобы получить Рр.
Поглощение воды и поток через клеточные мембраны является фундаментальным требованием для существования растений на клеточном и целых уровней растений. На клеточном уровне, аквапорины (AQPs) играют ключевую роль в регуляции осмотического коэффициента проницаемости воды (Р е) клеточной мембраны 1-3.
На сегодняшний день, несколько методов были использованы при измерении эндогенного Рр протопластовой из разных органов растений (т.е. корни, мезофилл, эндодерме, и т.д.., Отзывы на Шомон и др. 4). Один из подходов для измерения Рр является разоблачить протопластов в осмотического вызов и контролировать начальную скорость изменения объема (т.е.., Наклон начале линейной фазы изменения объема). Два различных метода были описаны ранее на основе этого подхода, как на основе мгновенного обмена решений. Первый состоит из immobilizчисле протопласта с всасывающим микропипетки и переключение поток раствора 5 и вторую передачи протопласта из одного раствора в другой с помощью микропипетки 6. Эти всасывающие микропипетка и микропипетка методы передача, которые позволяют захвата изображений в самом начале быстрого обмена раствора (захватить раннее линейную фазу изменения объема), вероятно, будут связаны физический стресс к протопластов и требуют специального оборудования и экспертных микроманипуляция.
Метод, описанный здесь минимизирует помехи для клеток, не влечет за микроманипуляция и позволяет вывод P F, когда ванна перфузии не мгновенно.
После ферментативного расщепления, протопласты, погруженные в изотоническом растворе, иммобилизуют на покровное стекло нижней части пластика (иначе Lucite или плексигласа) камеры путем взаимодействия заряда. Затем, в ходе постоянным ванны перфузии,изотонический раствор смывается с помощью гипотонического раствора, генерирующего гипоосмотическими вызов протопластов. Отек протопласта является видеозаписи, а затем, путем объединения информации о времени ход ванны перфузии и времени ход клеточного отека, P F определяется обработки изображений и аппроксимации кривой процедур.
Преимущества этого метода является то, что этот эксперимент не очень эффективным, т.е. можно контролировать несколько клеток одновременно в одном анализе, и что он не требует специального оборудования или особых навыков микроманипуляция. Несколько приложений для этого метода возможны. Например, определение родной P F разнообразных клетках из различных тканей и растений, таких как мезофилла и обкладки сосудисто-клеток из Arabidopsis листа 7, кукурузный мезофилла листа или корневых клетках коры 8-10 или суспензионных культурах клеток 11,12. В дополнительна, можно определить P F сферических клеток животных, таких как клетки ооцитов 11. Другой пример включает экспертизу AQP деятельности по временной экспрессии их генов в протопластов (или любых других генов, которые могут повлиять на них, например: гены киназ) и определение их вклада в P F; Например, экспрессия томатного AQP SlTIP2, 2 Arabidopsis в мезофильных протопластов путем трансформации ПЭГ и определения SlTIP2, 2, связанных с P F 13. Наконец, исследование влияния на P F различных молекул / веществ (наркотики, гормонов и т.д.) добавлен в растворах также могут быть рассмотрены, например в AQP блокатора HgCl 2 7.
Следующий протокол описывает выделение протопластов Arabidopsis мезофильных клетках и определение их P F.
Описанный здесь является простым и очень эффективная процедура для измерения Рр изолированных протопластов растений, применимые в принципе и к другим сферических ячеек, например., Лягушка ооцитов 11. Этот метод основан на измерении Рр в ответ на осмотическое вызо…
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана грантами от Национального фонда бельгийской для Научным гр исследований (FNRS), Межвузовский достопримечательности поляки Программа-бельгийской научной политики и "Русская община Бельгийского-действия де RECHERCHES Concertées" в ФК, от Израиля научного фонда Иерусалиме ( ISF) ММ (грант № 1311/12), и в Нью-Мексико (грант № 1312/12).
KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |