Medición de la osmótica de agua Coeficiente de Permeabilidad (P<sub> F</sub>) De células esféricas: protoplastos de plantas aisladas como ejemplo
Summary
Medición del coeficiente de permeabilidad al agua osmótica (P f) de las células puede ayudar a entender los mecanismos de regulación de las acuaporinas (AQPs). Determinación f P en protoplastos de células vegetales esféricas presentados aquí implica protoplastos aislamiento y análisis numérico de su tasa inicial de cambio de volumen como resultado de un desafío osmótica durante la perfusión baño constante.
Abstract
El estudio de los mecanismos de regulación AQP es crucial para la comprensión de las relaciones de agua, tanto en el celular y el conjunto de los niveles de la planta. Se presenta aquí un método sencillo y muy eficaz para la determinación del coeficiente de permeabilidad osmótica de agua (P f) en protoplastos de plantas, aplicable en principio también a otras células esféricas tales como oocitos de rana. El primer paso del ensayo es el aislamiento de protoplastos a partir del tejido vegetal de interés por digestión enzimática en una cámara con una solución isotónica adecuada. El segundo paso consiste en un ensayo de desafío osmótica: protoplastos inmovilizados en la parte inferior de la cámara están sometidos a una partida de perfusión constante con una solución isotónica y seguido por una solución hipotónica. La hinchazón celular es el vídeo grabado. En el tercer paso, las imágenes se procesan en línea para producir cambios de volumen, y el curso temporal de los cambios de volumen se correlaciona con la evolución en el tiempo del cambio en osmoladad del medio de perfusión cámara, usando un procedimiento de ajuste de curvas por escrito en Matlab (el 'PfFit'), para producir P f.
Introduction
La absorción de agua y el flujo a través de las membranas celulares es un requisito fundamental para la existencia de plantas, tanto en el celular y el conjunto de los niveles de la planta. A nivel celular, las acuaporinas (AQPs) juegan un papel clave en la regulación del coeficiente de permeabilidad al agua osmótica (P f) de la membrana celular 1-3.
Hasta la fecha, varios métodos han sido empleados en la medición de la P f endógena de protoplastos de diferentes órganos de la planta (es decir, raíces, mesófilo, endodermis, etc., Revisado por Chaumont et al. 4). Uno de los enfoques para medir P f es exponer los protoplastos a un desafío osmótica y para monitorear la tasa inicial de su cambio de volumen (es decir., La pendiente de la fase lineal inicial de la variación de volumen). Dos métodos diferentes se han descrito anteriormente sobre la base de este enfoque, tanto basados en un intercambio instantáneo de soluciones. La primera de ellas consiste en immobilizing la de protoplastos con una micropipeta de succión y cambiar el flujo de la solución 5 y el segundo de transferir la de protoplastos a partir de una solución a otra utilizando una micropipeta 6. Estos métodos de transferencia de aspiración micropipeta y micropipeta, que permiten la adquisición de imágenes en el comienzo mismo del intercambio solución rápida (para capturar la fase lineal inicial de cambio de volumen), probablemente involucre a un estrés físico de protoplastos y requieren equipo especializado y micromanipulación experto.
El método aquí descrito minimiza la perturbación a las células, no implica ningún micromanipulación y permite la derivación de P f cuando el baño de perfusión no es instantánea.
Después de la digestión enzimática, los protoplastos, sumergidas en una solución isotónica, se inmovilizan en la parte inferior cubreobjetos de vidrio de un plexiglás (también conocido como Lucite o plexiglás) por cámara de interacción de carga. Luego, durante un baño de perfusión constante,la solución isotónica es arrastrada por una solución hipotónica generar un desafío hipoosmótica a los protoplastos. La hinchazón de la protoplastos es de vídeo grabada y luego, mediante la combinación de la información sobre el curso temporal de la perfusión de baño y el curso temporal de la inflamación celular, la P f está determinada por el procesamiento de imágenes y los procedimientos de ajuste de curvas.
Las ventajas de este método son que el experimento es muy eficiente, es decir, es posible supervisar unas pocas células simultáneamente en un único ensayo, y que no requiere equipos especiales o particulares habilidades de micromanipulación. Varias aplicaciones para este método son posibles. Por ejemplo, la determinación de la P f nativa de una variedad de células de diferentes tejidos y plantas, tales como mesófilo y el paquete células de la vaina de la hoja de Arabidopsis 7, el maíz mesófilo de la hoja o células de la corteza de la raíz 8-10 o suspensión células cultivadas 11,12. En additien adelante, es posible determinar P f de las células animales tales como células esféricas 11 ovocitos. Otro ejemplo involucra la evaluación de la actividad AQP por la expresión transitoria de su gen en los protoplastos (o cualesquiera otros genes que puedan afectarles; por ejemplo, genes de quinasas) y determinación de su contribución a P f; por ejemplo, la expresión de tomate AQP SlTIP2; 2 de Arabidopsis en protoplastos de mesófilo de transformación PEG y la determinación de la SlTIP2; P 2 relacionada con f 13. Finalmente, el examen del efecto sobre P f de diferentes moléculas / sustancias (fármacos, hormonas, etc) que se añade a las soluciones también se puede examinar, por ejemplo, del bloqueador de AQP HgCl 2 7.
El siguiente protocolo describe el aislamiento de protoplastos de células y determinación de su P f Arabidopsis mesófilo.
Protocol
Representative Results
Discussion
Descrito aquí es un procedimiento sencillo y muy eficaz para medir la P f de protoplastos de plantas aisladas, aplicable en principio también a otras células esféricas, por ejemplo., Oocitos de rana 11. Este método se basa en la medición de la P f en respuesta a un desafío osmótica de la célula. En contraste con los otros métodos basados en este enfoque, sin embargo, el cambio de soluciones, es decir, de la osmolaridad, no es instantánea, pero gradual, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por becas del Fondo Nacional Belga para Científicos c Investigación (FNRS), el Interuniversitario de atracción polacos Programa-belga Política de Ciencia y la "Comunidad Francesa de Bélgica-Acciones de Recherches Concertées" a FC, de la Fundación de Ciencias de Israel Jerusalén ( ISF) a MM (Grant # 1311-12), y para NM (Grant # 1312-12).
Materials
| KCl | Chem-Impex International | 01247-1 | http://www.chemimpex.com Any source, anal. grade |
| CaCl2 | Merck | 11718006 | http://www.merck.com Any source, anal. grade |
| 2-(N-morpholine)-ethanesulphonic acid (MES) | Sigma | 15152002 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| D-Sorbitol | Sigma | 18032003 | http://www.sigmaaldrich.com Any source, anal. grade |
| Cellulase | Worthington, Lakewood, NJ, USA | LS002603 | http://www.worthingtonbiochem.com |
| Pectolyase | Karlan, Phonix, AZ, USA | 8006 | http://www.karlan.com |
| Polyvinyl-pyrrolidone K 30 (PVP) | Sigma | 81420 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A9418-5G | http://www.sigmaaldrich.com |
| Protamine sulphate | Sigma | P4380 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Poly-L-Lysine | Sigma | P8920 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Xylene cyanol | Sigma | X4126 | http://www.sigmaaldrich.com |
| Silicone vacuum grease heavy | Merck | 107921 | https://merck-chemicals.co.id/chemicals/silicone-high-vacuum-grease-heavy/MDA_CHEM-107921/p_LMib.s1Oxr4AAAEvXHg49in.?SecurePage=true&SEO_ErrorPageOccurred=true&attachments=CoA |
| Inverted microscope | Nikon | Eclipse TS100/TS100F | http://www.nikoninstruments.com |
| Peristaltic pump | BIO-RAD | EP-1 Econo Pump | http://www.bio-rad.com |
| Grayscale digital camera | Scion Corporation | CFW-1308M | http://www.scioncorp.com |
| CMU 1394 Camera Driver’ plugin for ImageJ | Carnegie Mellon | http://www.cs.cmu.edu/~iwan/1394/download.html Free software |
|
| ImageJ | NIH | http://rsb.info.nih.gov/ij/ Free software |
|
| Econo Gradient Pump Fittings Kit | BIO-RAD | 731-9006 | http://www.bio-rad.com |
| Connectors, manifold | DirectMed | http://directmed.com/main/Plastic-Medical-Tubing-Connectors.html?ACTION=S | |
| Burette infusion sets (columns) | Welford | IF-BR-001 | http://www.welfordmedical.com/content.php?id=61 |
| Tubing | TYGON | R-3603 | http://www.usplastic.com |
| Plexiglass slide etc. | Perspectiv | http://www.perspectiv.co.il/index-en.html Our slide was custom-made, it does not appear on the web site but a copy can be remade to order as 'a copy of the slide already made for M. Moshelion'. |
|
| 3M packaging Scotch tape 1'', clear | Viking Industrial, UK | VKMONO25 | http://www.vikingtapes.co.uk/c-428-vkmono-mono-filament-tape.aspx#.UuvqOftdy_8 any clear adhesive tape (sellotape, etc.) is likely to be OK |
References
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