タンパク質相互作用:SILACの免疫沈降実験は、新規タンパク質を発見するための強力な手段を表す。対照および試験試料の両方におけるタンパク質存在量の正確な相対的定量を可能にすることによって、真の相互作用は、実験的な汚染物質から容易に区別することができ、低親和性相互作用は、あまりストリンジェントな緩衝液条件を使用することによって保存した。
タンパク質相互作用:免疫親和性精製、SILAC免疫沈降と組み合わせる定量的プロテオミクスは、新規タンパク質の発見のための強力な手段を表す。対照および試験試料の両方におけるタンパク質存在量の正確な相対的定量を可能にすることによって、真の相互作用は、実験的な汚染物質から容易に区別することができる。低親和性相互作用は、あまりストリンジェントな緩衝液条件を使用することによって保存され、容易に識別残ることができる。このプロトコルは、安定同位体標識アミノ酸で組織培養細胞の標識について説明し、親和性のトランスフェクションおよび免疫沈降は、質量分析施設に提出する準備に続く目的のタンパク質を、タグ付けされた。このプロトコルは、その後、目的のタンパク質と相互作用し、携帯パートナーを同定するために、質量分析装置から返されたデータを分析し、解釈する方法について説明します。一例として、この技術はiDENのに適用されるeIF4AIととeIF4AII:真核生物翻訳開始因子に結合するタンパク質をtify。
タンパク質の機能を理解する上で重要なステップは、関連する相互作用するタンパク質の同定である。このようなタンパク質が知られていない場合には、利用可能な技術、自分の長所と欠点を持つそれぞれがいくつかあります。これらには、組換えタンパク質、ならびにタンデムアフィニティー精製またはTAP-タグ付け1,2を用いて、酵母ツーハイブリッドシステム、プルダウンアッセイが含まれる。
これらの技術のより最近の添加は、細胞培養(SILAC)3におけるアミノ酸の安定同位体標識を用いた定量的質量分析に続いて、関連する哺乳動物細胞株から目的のタンパク質のアフィニティー精製の 組み合わせである。これは、そのセルのローカライズおよび翻訳後修飾における酵母ツーハイブリッド手法に比べて利点が乱されていないしていだけでなく、伝統的に勝る利点それはREAにユーザーを許可する量的ではなく質的なアプローチであることをTAPは、タグ付けdily特異的に結合する宿主因子から、非特異的に相互作用するタンパク質と汚染物質を区別します。試料は、典型的には、全体ではなく、個々のタンパク質バンドとして分析されるように、さらに、目的のタンパク質は、同様に、ゲル上にタンパク質を移行することによって、マスクされていない、また彼らは、典型的には、染色後に表示されるように十分なレベルで存在する必要はない、につながる自信を持って同定されたタンパク質4の数を増加させた。
この手法を実証するために、密接に関連した真核生物の翻訳開始因子とeIF4AII eIF4AIとGFPの融合は、そのシェアの90%以上のアミノ酸同一性は、免疫沈降SILAC定量的プロテオミクスにより調べた。ヒトeIF4AIとIIとはGFPがeIF4AはのN末端に融合する融合タンパク質を形成するためのpEGFP-C1にクローニングした。一過性のトランスフェクションは、安定同位体標識された293T細胞へのこれらの構築物を送達するために使用した安定な細胞株を生成するための必要性を回避する。
<p class="「jove_contentは" ">細胞を、最初に、目的のタンパク質をコードするプラスミドDNAのトランスフェクションに続いてSILAC細胞培養培地中で2週間のために標識した。次いで、細胞を、溶解し、タンパク質濃度を正規化し、溶解物の親和性の等量は、抗GFPアガロースで精製した。溶出液の等量混合し、次いでLC-MS/MS分析に供した。この分析の結果は、高い信頼性タンパク質を同定するために処理される:タンパク質相互作用( 図1)。SILAC免疫沈降は、直接相互作用だけでなく、低親和性またはタンパク質複合体4との間接的な相互作用だけではないの同定を可能にする。このシステムを使用して、eIF4AIとおよびII免疫沈降は、一次的な結合パートナーのeIF4G(アイソフォームI / IIおよびIII)5だけでなく、のeIF4Eとの間接的な相互作用、およびeIF3複合体の多数の部品の再現性があり、自信を持って同定を可能にした。
ここで説明するSILACプルダウン戦略は、新規タンパク質を検出することが非常に敏感でパワフルな手段である:タンパク質相互作用を、さらに興味のある密接に関連し、サンプル間の変化した結合パターンの迅速かつ簡単な識別を可能にする。 eIF4AIとしeIF4AII 6タンパク質のタンパク質相互作用:この例では、この技術は、タンパク質を調べるために使用した。筆者の知る限り、これはeIF4Aは、これら二つのアイソフォームの細胞インタラクトームを調査するSILACプロテオミクスの有用性を悪用する文献で最初の研究である。
上述したようなアプローチは、GFP-タグおよび抗-GFPビーズ9を使用して、10及びそれ故に修飾はタグがN-もしくはに配置されているかどうかを、例えば、関心対象の特定のタンパク質に使用するこのアプローチを有効にするために必要とされ得るタンパク質のC末端。可能な場合には、ウエスタンブロットまたは機能アッセイすべき既知のタンパク質相互作用パートナーの結合を検出するために実行することができる。タンパク質は、GFPタグ、他のタグ付けまたはプルダウン戦略は両方他のタグを用いてSILACのプルダウンに適用された(FLAG 11、ビオチン12、STREP(自身のデータ、未発表))、又はタンパク質に対する一次抗体を用いて、との融合を許容してはならない興味の標的タンパク質のsiRNAノックダウンは、対照試料13を提供する場合。このような実験は、文献に他の場所に記載されているが、簡単に、ステップ1およびステップは5.4から8にはで説明したように等しいタンパク質の入力を使用して、選択した表現/プルダウンシステムに応じて変更したステップ2から5.3で、上記のように適用される2.4-2.5を繰り返します。定量化段階は非特異的結合タンパク質は、分析レベルで除去することを可能にするように、低親和性タンパク質を保持するために、対照ビーズ、又は高塩洗浄でプレインキュベーションを省略することが推奨される:関心対象のタンパク質とのタンパク質相互作用。ヌクレアーゼMAyが含まれているか、または特定の実験の詳細に応じて、このプロトコルを省略してもよい。次に例を示します。この方法で使用されるタンパク質はRNAヘリカーゼであるとして、RNアーゼカクテルは、RNA(ステップ3.2)を介して媒介間接相互作用を除去するために、プロトコルに含まれていた。場合によっては、しかし、核酸依存性相互作用を識別するために、ヌクレアーゼでとすることなく、平行実験を実行してそこから利益を得ることができた。
このプロトコルの中では、「中」、および反復実験での「重い」サンプルの切り替えは、SILACメディアまたは細胞増殖の違いによって導入変動を制御することが推奨されます。代替コントロールは、レプリカ実験のすべての3(「光」、「中」、および「重い」)メディアの順次切り替えを必要とする。このアプローチは、潜在的に、より厳格であるが、それは、少なくとも一つの複製、目的のタンパク質重量のように、分析の複雑さを増大しない病気「光」標識された細胞で産生されそしてそれは一貫して「光」のサンプル(たとえば、ケラチンなどの環境汚染物質)とのタンパク質に結合した場合にのみ、「光」のサンプルが濃縮されているもので同定されたタンパク質を区別する必要があるインタレスト。
定量データを用いながら、必然的にいくつかの本物の相互作用が破棄されてもよい、閾値の使用を介して特定の非特異的相互作用の区別が可能になる。タンパク質相互作用データセット:簡単に以前の質量分析と経験、または大規模なタンパク質の分析と研究者が試みることができるタンパク質の相互作用:上記のアプローチは、タンパク質を同定する簡単かつ迅速なアプローチです。ほとんどの用途では、これは、目的の新規なタンパク質を同定するために十分以上である。このデータ損失を削減するために、このアプローチのさらなる修飾は他の文献で記載され、広報の使用が含まれている実験パラメータ(細胞株、ビーズマトリックス、緩衝液条件)の特定のセットのための夾雑タンパク質を公知otein周波数ライブラリーは、10、14を除外してもよい。しかし、特定の実験パラメータに依存し、それはビードプロテオームを生成するために、対照実験の数を実行する必要があり、これは、したがって、実験の費用と複雑さの両方を増加させることができる。この手法の詳細については、www.peptracker.co.ukウェブサイト14から提供されています。
また、プロトコルは( – MAPのSILAC実験を精製した後、ミキシングと呼ばれる)免疫沈降プロセスの最後に異なって標識されたサンプルを混合することを含む前述のことに留意すべきである。これは、タンパク質として行われます。タンパク質相互作用は、指定された平衡15で発生。それは、他のグループはサンプルのインキュベーションで、このプロトコルで説明このマップSILACのアプローチを組み合わせていることに留意すべきである異なる長さの時間(2時間まで20分文献で 使用されている)15、16 -プルダウン(PAM SILACミキシングした後、精製して、)の前に。タンパク質比が1:1に向かって急速に低下する方法に基づいて、定性的に結合親和性を調査するために、安定したまたは動的な相互作用タンパク質15として蛋白質を定義することが可能である。
要約すると、SILACのプルダウンは、生理学的に適切な設定では、対象とする特定のタンパク質と相互作用するタンパク質を同定するのに非常に強力な手段を表している。技術は、非常に簡単に目的の任意の所定のタンパク質への応用を可能にする、異なる精製戦略の数に適合させることができる。結果の定量化は非常に本物の相互作用の同定を単純化し、非特異的結合剤を除去するために使用されるストリンジェントな緩衝条件の緩和を可能にし、従って低親和性相互作用を維持する。最大3つのサンプルを、上記に比較することができるように戦略は、技術が異なるタンパク質アイソフォーム、変異体タンパク質、または薬理学的阻害剤の効果の間の結合蛋白質の違いを比較することで明らかに強みを持っています。全体のゲルスライスではなく個々のバンドクマシーによって染色よりも分析されるように、高い信頼度で同定されたタンパク質の数は、典型的には、標準的なGST / TAP-プルダウンで同定されたものよりも高い、目的のタンパク質を選択する際にバイアスを実験者に除去される。技術は、したがって、新規タンパク質 – 相互作用(酵母2 – ハイブリッド、GST / HisまたはTAPプルダウン)の識別に使用される他の一般的に使用される技術では非常に好意的に比較します。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、IGのウェルカムトラストとBBSRCからの補助金によって支えられている。 IGがウェルカムシニアフェローである。
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) | Dundee Cell Products | LM010 | DMEM lacking Arginine and Lysine. (and containing L-glutamine) |
Dialysed FBS (10kDa cutoff) 500ml | Dundee Cell Products | DS1003 | |
Arginine (R0) 25g | Sigma-Aldrich | A8094 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R6) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CLM-2265 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Arginine (R10) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-539 | Resuspend 0.5g in 6ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 84mg/ml stock) |
Lysine (K0) 25g | Sigma-Aldrich | L8662 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K4) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | DLM-2640 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Lysine (K8) 0.5g | Cambridge Isotope Labs | CNLM-291 | Resuspend 0.5g in 3.5ml PBS, filter sterilize, and freeze in 0.5ml aliquots (gives a 146mg/ml stock) |
Penicillin-Streptomycin, Liquid. 100ml | Gibco | 15140-122 | |
Lipofectamine 2000 transfection reagent | Invitrogen | 11668-027 | |
GFP-trap Agarose (500μl resin) | Chromotek | gta-20 | |
5x SDS Sample loading buffer | Fisher Scientific | PN39000 | The use of purchased rather than homemade sample buffer is recommended to minimize keratin contamination. |
Protease inhibitor cocktail set III | Calbiochem | 539134 | |
1.7ml prelubricated tubes | Costar | 3207 | |
BCA protein assay kit (1L) | Pierce | 23225 | |
Tris (Trizma) | Sigma-Aldrich | T1503 | |
Ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) | Sigma-Aldrich | E6758 | |
Sodium Chloride | Sigma-Aldrich | S3014 | |
Rnase cocktail | Ambion | AM2286 | |
NP-40 alternative | Millipore | 492016 |