Protocolo SIVQ-LCM para el Instrumento ArcturusXT
Summary
SIVQ-LCM es un enfoque innovador que aprovecha un algoritmo informático, espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ), para conducir el proceso de microdisección láser captura (LCM). El flujo de trabajo SIVQ-LCM mejora en gran medida la velocidad y la exactitud de microdisección, con aplicaciones tanto en la investigación y ajustes clínicos.
Abstract
SIVQ-LCM es una nueva metodología que automatiza y simplifica el proceso de disección con láser depende del usuario más tradicional. Su objetivo es crear una avanzada tecnología de la plataforma de disección láser, rápido personalizable. En este reporte se describe la integración del software de análisis de imágenes espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ) en el instrumento ArcturusXT. El sistema ArcturusXT contiene tanto un puerto de infrarrojos (IR) y ultravioleta (UV) de láser, lo que permite celular específico o grandes disecciones de la zona. El objetivo principal es mejorar la velocidad, la precisión y reproducibilidad de la disección con láser para aumentar el rendimiento de la muestra. Este nuevo enfoque facilita la microdisección de animales y tejidos humanos en la investigación y los flujos de trabajo clínicos.
Introduction
Originalmente desarrollado en la década de 1990, la microdisección de captura por láser (LCM) permite al usuario capturar con precisión las células específicas o regiones celulares de una sección de tejido histológico mediante visualización microscópica 1, 2. Muchos estudios que comparan el análisis molecular de LCM contra raspaduras de tejido ilustran el valor del método de 3-12. Además, hay tres publicaciones de protocolo de vídeo sobre la tecnología que están disponibles para su visualización 13, 14. Sin embargo, a pesar de su acreditado valor, LCM puede ser tedioso y laborioso cuando el objetivo de interés es una población de células dispersas en una sección de tejido heterogéneo, o cuando un gran número de células se necesitan para las aplicaciones posteriores específicos como la proteómica. La carga que supone para el operador humano nos ha llevado a desarrollar un enfoque disección semi-automatizado para LCM mediante la combinación de un potente algoritmo de análisis de imágenes para guiar el proceso de LCM 15.
<p class = "jove_content"> En colaboración con la Universidad de Michigan, el laboratorio en el NIH extendió el previamente desarrollado y reportado espacialmente invariante cuantificación vectorial (SIVQ) algoritmo de una manera que le permita a semi-automatizar el proceso de selección de los tejidos intrínseca a microdisección guiada, con lo que dispone de una herramienta con el patólogo o científico vida en mente. Espacialmente invariantes cuantificación vectorial (SIVQ) es un algoritmo que permite al usuario simplemente "clic" en una característica histológica de interés para crear un vector de anillo (función de imagen de predicado) que se puede utilizar para buscar en toda la imagen histológica, ajustando el umbral estadístico según sea necesario 16-21. El mapa de calor resultante muestra la calidad de los partidos a la función inicial de la imagen predicado y se convierte posteriormente en un solo color (rojo) Mapa de la anotación en la que se puede importar en el instrumento LCM. El software de selección automatizado, AutoScanXT, entonces se utiliza para dibujar un mapa basadoen la anotación de SIVQ guiar la captura de las células diana de la muestra de tejido. El protocolo se detalla a continuación se describe la implementación de SIVQ al flujo de trabajo de microdisección.Protocol
Representative Results
Discussion
Se presenta un protocolo para la aplicación de SIVQ-LCM a microdissect células epiteliales immunostained de FFPE tejido mamario humano. El uso de un algoritmo de análisis de imágenes, tales como SIVQ, reduce la cantidad de manos sobre el tiempo requerido para el proceso de microdisección. Este es un avance potencialmente importante para el campo desde el tiempo del operador y esfuerzo es típicamente el paso limitante de la velocidad para la disección precisa de las células de interés. En el presente protocolo, …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El estudio fue apoyado en parte por el Programa de Investigación Intramural de los Institutos Nacionales de Salud, Instituto Nacional del Cáncer, el Centro para la Investigación del Cáncer.
Materials
| Positive Charged Glass Slides | Thermo Scientific | 4951Plus-001 | |
| Xylenes, ACS reagent, ≥98.5% xylenes + ethylbenzene basis | Sigma Aldrich | 247642 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous | The Warner-Graham Company | 6.505E+12 | CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES. |
| Arcturus CapSure Macro LCM Caps | Life Technologies | LCM0211 | |
| ArcturusXT Laser Microdissection Instrument | Life Technologies | ARCTURUSXT | |
| AutoScanXT Software | Life Technologies | An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM. | |
| Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ) | University of Michigan | This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu] |
References
- Bonner, R. F., et al. Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue. Science. 278, 1481-1483 (1997).
- Emmert-Buck, M. R., et al. Laser capture microdissection. Science. 274, 998-1001 (1996).
- Edwards, R. A. Laser capture microdissection of mammalian tissue. J Vis Exp. (8), (2007).
- El-Serag, H. B., et al. Gene expression in Barrett’s esophagus: laser capture versus whole tissue. Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).
- Espina, V., et al. Laser-capture microdissection. Nature. 1, 586-603 (2006).
- Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases. Clinical & experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).
- Rodriguez-Canales, J., et al. Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications. Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).
- Silvestri, A., et al. Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing. Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).
- Eberle, F. C., et al. Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens. The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).
- Kim, H. K., et al. Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection. BMC medical genomics. 4, 48 (2011).
- Klee, E. W., et al. Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling. BMC medical genomics. 2, 13 (2009).
- Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine. PloS one. 8, e53711 (2013).
- Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury. J Vis Exp. (74), (2013).
- Iyer, E. P., Cox, D. N. Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons. J Vis Exp. (39), (2010).
- Hipp, J., et al. SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling. Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).
- Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology. J Pathol Inform. 2, 13 (2011).
- Hipp, J., et al. Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm. Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).
- Hipp, J., et al. Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification. Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).
- Hipp, J., et al. Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ. Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).
- Cheng, J., et al. Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies. Journal of pathology. 2, 37 (2011).
- Roy Chowdhuri, S., et al. Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples. Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).
- Hipp, J., et al. Image Microarrays (IMA): Digital Pathology’s Missing Tool. Journal of pathology. 2, (2011).
- Hanson, J. C., et al. Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments. Nature. 6, 457-467 (2011).
