Levande cell imaging av Primär Rat Neonatal Cardiomyocytes Efter Adenoviral och Lentiviral Transduction Använda Konfokal Spinning Disk mikroskopi
Summary
This protocol describes a method of live cell imaging using primary rat neonatal cardiomyocytes following lentiviral and adenoviral transduction using confocal spinning disk microscopy. This enables detailed observations of cellular processes in living cardiomyocytes.
Abstract
Primär råtta neonatal cardiomyocytes är användbara i grundläggande in vitro kardiovaskulär forskning, eftersom de lätt kan isoleras i stort antal i ett enda förfarande. På grund av framsteg inom mikroskopteknik är det relativt enkelt att fånga levande cellbilder i syfte att undersöka cellulära händelser i realtid med minimal oro angående fototoxicitet till cellerna. Detta protokoll beskriver hur man tar levande cell Timelapse bilder av primär råtta neonatal cardiomyocytes med hjälp av en konfokala spinning disk mikroskop efter lentiviral och adenoviral transduktion för att modulera egenskaper i cellen. Tillämpningen av två olika typer av virus gör det lättare att uppnå en lämplig transduktion ränta och uttrycksnivåer för två olika gener. Väl fokuserade levande cellbilder kan erhållas med hjälp av mikroskop s autofokussystem, som upprätthåller stabil fokus under långa tidsperioder. Att tillämpa denna metod, funktioner exogent ingenjöred proteiner som uttrycks i odlade primära cellerna kan analyseras. Dessutom kan detta system användas för att undersöka funktionen av gener genom användning av siRNA liksom av kemiska modulatorer.
Introduction
Primära råttneonatala hjärtmuskelceller har länge använts för att undersöka cardiomyocyte funktion in vitro 1. De är lätta att isolera från råttungar av flera väl etablerade metoder 2-4. Den vanligaste metoden använder kollagenas eller trypsin för att smälta bindväv av hjärtat före cellisolering. Forskare har också utvecklat metoder för att isolera hjärtmuskelceller från vuxna gnagare 5-8 samt neonatala möss 9,10.
Detta protokoll beskriver en metod för isolering av kardiomyocyter från neonatala råttungar, som utnyttjar en två-stegs enzymdigere procedur. Trypsin används först O / N vid 4 ° C, och sedan renade kollagenas vid 37 ° C. Inkubation av hjärtvävnad med trypsin O / N vid 4 ° C reducerar nödvändiga åtgärder för att skörda celler jämfört med metoder som använder sekventiella inkubationer i en varm enzymlösning 2. Dessutom, genom användning av renat collagenase snarare än råa enzymer, kan mycket-till-lot variation elimineras, vilket ger förbättrad reproducerbarhet.
Funktionella studier av ett särskilt protein har man ofta en proteinexpressionssystem med användning av ett adenovirus 11 till 13 och / eller ett lentivirus 14-16. [Varnande anmärkning] Den virala produktion och manipulation bör utföras enligt NIH riktlinjer.
Adenovirus integrerar inte in i värdgenomet. Den har en mycket hög effektivitet av transduktion i de flesta celltyper, inklusive delande celler och icke-delande celler, såväl som primära celler och etablerade cell-linjer. Detta gör adenovirus en tillförlitlig vektor för genuttryck. Höga nivåer av det protein som kodas av adenovirusvektorn utvecklas inom 48 timmar efter transduktion, och de kan pågå i flera veckor 17. Men en nackdel med att använda ett adenovirus för proteinexpression är att utvecklingen av en rekombinant adenovirus är både komplicerat och tidskrävande. Denna nackdel förklarar delvis varför många forskare har vänt sig till lentiviruses för rekombinant genuttryck. Till skillnad adenovirala konstruktioner, genererar en lentiviral konstruktion är snabbt och enkelt. Även lentiviruses har generellt lägre effektivitet på transduktion än adenovirus, både delande och icke-delande celler, de integreras i värdgenomet. Följaktligen är uttryck för den omvandlade genen stabilare för lentiviruses än för adenovirus.
På grund av tekniska framsteg inom området mikroskopi, är det mycket lättare att fånga levande cell bilder av celler som uttrycker rekombinanta proteiner. Detta gäller även vid videohastighet hastigheter på förvärv. Detta möjliggör för forskaren att bestämma hur vissa förändringar i proteinet av intresse funktionellt påverka cellen i realtid. Den konfokala spinning disk mikroskop har flera viktiga funktioner som gör det en optimal teknik för live cell imaging 18,19. Den Yokogawa snurrande skiva möjliggör en mycket snabbare bildtagning, medan samtidigt utnyttjar mycket mindre lasereffekt än punkt scanning konfokala mikroskop. Båda dessa särdrag är på grund av den roterande skiva, som innehåller ett flertal konfokala hål genom vilket lasern passerar samtidigt till proverna. Vid förvärv, själva disken snurrar snabbt och kontinuerligt 18-20. Genom att använda autofokussystemet i mikroskopet, är stabil fokus bibehålls under långa tidsperioder. Detta gör det möjligt för forskare att ta väl fokuserade levande cellbilder. Förvärvade bilderna spelas upp som en filmfil. Bilderna analyseras med hjälp av bildanalys program som ImageJ 21,22, FIJI 23, eller annan kommersiellt tillgänglig programvara.
Protocol
Representative Results
Discussion
Primära kardiomyocyter isolerade från neonatala råttor har länge använts för att studera cardiomyocyte funktioner in vitro. Detta protokoll beskriver en metod för isolering av neonatala hjärtmuskelceller från råttungar genom att använda en två-stegs enzymdigere metoden först digerering med trypsin O / N vid 4 ° C och därefter renat kollagenas. En fördel med användning av renat kollagenas steget är att samma grad av enzym används för alla isoleringar. Således är kvaliteten och mängden av i…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We would like to thank Dr. Alengo Nyamay’antu and Dr. Ilse Timmerman for their advices about lentiviral packaging. This work is supported by an American Heart Association Scientist Development Grant 10SDG4170137.
Materials
| 1 scissors for decapitation | WPI | 501749 | Autoclave before use |
| 1 fine scissors for heart isolation and chopping | WPI | 14393 | Autoclave before use |
| 2 fine forceps (Dumont No. 5) | Sigma | F6521 | Autoclave before use |
| Three sterilized 10 cm plastic dishes | Sigma | CLS430165 | for hearts isolation |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-1.5-20-C | for final plating of cardiomyocytes for future live cell imaging. micro-Dishes from ibidi are an acceptable alternative. |
| 3.5 cm glass bottom culture dishes | MatTek | P35G-0.17-14-C | for TIRF or high resolution image |
| Ethanol solution, 70 % (v/v) in water | Sigma | E7148 | |
| 2% gelatin | Sigma | G1393 | |
| One sterilized 10 cm plastic dish | Sigma | CLS430165 | for trypsinization |
| Aluminium foil | any brand | ||
| parafilm | Sigma | P7543 | |
| Two 10 cm plastic cell culture dish | Sigma | CLS430165 | for selection |
| Auto pipette | Drummond Scientific | 4-000-300 | for trituration |
| Cell counter | |||
| Cellometer, automated cell counter | nexcelom | to check and count cells | |
| Microscope and Hematocytometer | any brand | to check and count cells | |
| Trypan Blue Solution, 0.4% | invitrogen | 15250-061 | |
| CO2 incubator | Sanyo | MCO-19AIC | |
| incubating orbital shaker | Sigma | Z673129 | to shake heart tissue with collagenase at 37 C at 170-200 rpm |
| 10 mg/ml BrdU solution | BD Pharmingen | 550891 | |
| DMEM, High Glucose | invitrogen | 41965039 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| MEM | invitrogen | 31095029 | Mix medium as indicated in the protocol and warm before use |
| Fetal Bovine Serum | invitrogen | 26140079 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | invitrogen | 15140-122 | |
| Section 2 lentiviral transduction | |||
| three packaging plasmids | |||
| pMDLg/pRRE | Addgene | 12251 | |
| pRSV-Rev | Addgene | 12253 | |
| pMD2.G | Addgene | 12259 | |
| The lentiviral transfer vector, pLVX-IRES-Puro | Clontech | 632183 | |
| Opti-MEM (serum-free medium) | invitrogen | 31985070 | |
| transfection reagent | |||
| polyethyleneimine“Max”, (Mw 40,000) – High Potency Linear PEI (Equivalent to Mw 25,000 in Free Base Form) | Polysciences | 24765-2 | It can be substituted with X-tremeGENE 9 from Roche |
| X-tremeGENE 9 | Roche | 6365779001 | substitute for PEI as transfection reagent |
| chloroquine | Sigma | C6628 | dissolve in water and make 100 mM stock solution. Inhibition of endosomal acidification can be achieved with 10-100 μM Chloroquine. |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| 10 ml Luer-Lok syringe, sterilized | BD | 309604 | |
| 0.45 um filters | Sigma | F8677 | use only cellulose acetate or polyethersulfone (PES) (low protein binding) filters. Do not use nitrocellulose filters. Nitrocellulose binds surface proteins on the lentiviral envelope and destroys the virus. |
| Hexadimethrine bromide | Sigma | H9268 | dissolve in water and make 8mg/ml stock solution, then filter it to sterilize. |
| polyethylene glicol 6000 | Sigma | 81260 | |
| Sodium chloride | Sigma | S9888 | |
| sodium hydroxide | Sigma | S5881 | |
| Section 3 Adenoviral transduction | |||
| HEK 293T cells | ATCC | CRL-11268 | |
| Some 10 cm cell culture dishes | Sigma | CLS430165 | |
| 96-Well Microplate with lid, flat-bottom, tissue culture, sterile | BD Falcon | 353072 | for titration |
| Multichannel piptte, 10-100 ul, 8-channel | eppendorf | 3122 000.035 | |
| Section 4 live cell imaging | |||
| Spinning disk confocal microspopy | PerkinElmer | L7267000 | |
| a temperature controlled chamber | any brand | to keep temperature at 37 C | |
| a CO2 environmental system | any brand | optional to maintain CO2 concentration optimal | |
| Medium | |||
| CO2 Independent Medium, No Glutamine | invitrogen | 18045-054 | for long time time-lapse imaging |
| DMEM, High Glucose, HEPES, no Phenol Red | invitrogen | 21063-029 | for long time time-lapse imaging |
References
- Gross, W. O., Schopf-Ebner, E., Bucher, O. M. Technique for the preparation of homogeneous cultures of isolated heart muscle cells. Experimental cell research. 53, 1-10 (1968).
- Toraason, M., Luken, M. E., Breitenstein, M., Krueger, J. A., Biagini, R. E. Comparative toxicity of allylamine and acrolein in cultured myocytes and fibroblasts from neonatal rat heart. Toxicology. 56, 107-117 (1989).
- MacGregor, R. R., Klein, R. M., Bansal, D. D. Secretion of plasminogen activator activity from neonatal rat heart cells is regulated by hormones and growth factors. Annals of the New York Academy of Sciences. 752, 331-342 (1995).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. Journal of molecular and cellular cardiology. 51, 288-298 (2011).
- Wolska, B. M., Solaro, R. J. Method for isolation of adult mouse cardiac myocytes for studies of contraction and microfluorimetry. The American journal of physiology. , 271-1250 (1996).
- Kaestner, L., et al. Isolation and genetic manipulation of adult cardiac myocytes for confocal imaging. J Vis Exp. 31 (31), (2009).
- Xu, X., Colecraft, H. M. Primary culture of adult rat heart myocytes. J Vis Exp. 28 (28), (2009).
- Pinz, I., Zhu, M., Mende, U., Ingwall, J. S. An improved isolation procedure for adult mouse cardiomyocytes. Cell biochemistry and biophysics. 61, 93-101 (2011).
- Sreejit, P., Kumar, S., Verma, R. S. An improved protocol for primary culture of cardiomyocyte from neonatal mice. In vitro cellular & developmental biology. Animal. 44, 45-50 (2008).
- Ehler, E., Moore-Morris, T., Lange, S. Isolation and Culture of Neonatal Mouse Cardiomyocytes. J Vis Exp. 79 (79), (2013).
- Kass-Eisler, A., et al. Quantitative determination of adenovirus-mediated gene delivery to rat cardiac myocytes in vitro and in vivo. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 11498-11502 (1993).
- Wasala, N. B., Shin, J. H., Duan, D. The evolution of heart gene delivery vectors. The journal of gene medicine. 13, 557-565 (2011).
- Metzger, J. M. . Cardiac Cell and Gene Transfer: Principles, Protocols, and Applications. , (2003).
- Naldini, L., et al. In vivo gene delivery and stable transduction of nondividing cells by a lentiviral vector. Science. 272, 263-267 (1996).
- Zhao, J., et al. Lentiviral vectors for delivery of genes into neonatal and adult ventricular cardiac myocytes in vitro and in vivo. Basic research in cardiology. 97, 348-358 (2002).
- Bonci, D., et al. Advanced’ generation lentiviruses as efficient vectors for cardiomyocyte gene transduction in vitro and in vivo. Gene therapy. 10, 630-636 (2003).
- Murakami, M., et al. The FGF system has a key role in regulating vascular integrity. The Journal of clinical investigation. 118, 3355-3366 (2008).
- Nakano, A. Spinning-disk confocal microscopy — a cutting-edge tool for imaging of membrane traffic. Cell structure and function. 27, 349-355 (2002).
- Adams, M. C., et al. A high-speed multispectral spinning-disk confocal microscope system for fluorescent speckle microscopy of living cells. Methods (San Diego, Calif. 29, 29-41 (2003).
- Wilson, T. Spinning-disk microscopy systems. Cold Spring Harbor protocols). 2010, pdb top88, doi:10.1101/pdb.top88. , (2010).
- Collins, T. J. ImageJ for microscopy. BioTechniques. 43, 25-30 (2007).
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nature. 9, 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nature. 9, 676-682 (2012).
- Wang, X., McManus, M. Lentivirus production. J Vis Exp. 32 (32), (2009).
- Li, M., Husic, N., Lin, Y., Snider, B. J. Production of lentiviral vectors for transducing cells from the central nervous system. J Vis Exp. 63 (63), 10-3791 (2012).
- Mendenhall, A., Lesnik, J., Mukherjee, C., Antes, T., Sengupta, R. Packaging HIV- or FIV-based lentivector expression constructs and transduction of VSV-G pseudotyped viral particles. J Vis Exp. 62 (62), 10-3791 (2012).
- Durocher, Y., Perret, S., Kamen, A. High-level and high-throughput recombinant protein production by transient transfection of suspension-growing human 293-EBNA1 cells. Nucleic acids research. 30, (2002).
- Erbacher, P., Roche, A. C., Monsigny, M., Midoux, P. Putative role of chloroquine in gene transfer into a human hepatoma cell line by DNA/lactosylated polylysine complexes. Experimental cell research. 225, 186-194 (1996).
- McSharry, J., Benzinger, R. Concentration and purification of vesicular stomatitis virus by polyethylene glycol ‘precipitation’. Virology. 40, 745-746 (1970).
- Wulff, N. H., Tzatzaris, M., Young, P. J. Monte Carlo simulation of the Spearman-Kaerber TCID50. Journal of clinical. 2, 10-1186 (2012).
- Kaerber, G. . Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. In: Beitrag zur kollektiven Behandlung pharmakologischer Reihenversuche. 162. , (1931).
- Sakurai, T., Tsuchida, M., Lampe, P. D., Murakami, M. Cardiomyocyte FGF signaling is required for Cx43 phosphorylation and cardiac gap junction maintenance. Experimental cell research. 319, 2152-2165 (2013).
- Ueno, H., Gunn, M., Dell, K., Tseng, A., Williams, L. A truncated form of fibroblast growth factor receptor 1 inhibits signal transduction by multiple types of fibroblast growth factor receptor. The Journal of biological chemistry. , 267-1470 (1992).
- Li, Y., Basilico, C., Mansukhani, A. Cell transformation by fibroblast growth factors can be suppressed by truncated fibroblast growth factor receptors. Molecular and cellular biology. 14, 7660-7669 (1994).
- Murakami, M., et al. FGF-dependent regulation of VEGF receptor 2 expression in mice. The Journal of clinical investigation. 121, 2668-2678 (2011).
- Bazan, C., et al. Contractility assessment in enzymatically isolated cardiomyocytes. Biophysical reviews. , 231-2310 (2012).
- Clark, W. A., Rudnick, S. J., Simpson, D. G., LaPres, J. J., Decker, R. S. Cultured adult cardiac myocytes maintain protein synthetic capacity of intact adult hearts. The American journal of physiology. , 264-573 (1993).
