Analyse de l'altération de l'épithélium Produit par Entamoeba histolytica Maladies infectieuses

Summary

L'infection humaine par E. histolytica conduit à l'amibiase, une cause majeure de diarrhée dans les pays tropicaux. L'infection est initiée par l'interaction d'agents pathogènes sur des cellules épithéliales de l'intestin, provoquant l'ouverture des contacts cellule-cellule et par conséquent, une diarrhée, parfois suivie d'une infection du foie. Cet article fournit un modèle pour évaluer les premières interactions hôte-pathogène pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase.

Abstract

Entamoeba histolytica est l'agent causal de l'amibiase humaine, une cause majeure de diarrhée et abcès du foie dans les pays tropicaux. L'infection est initiée par l'interaction de l'agent pathogène aux cellules épithéliales de l'intestin. Cette interaction conduit à la rupture des structures intercellulaires tels que les jonctions serrées (TJ). TJ assurer l'étanchéité de la couche epitheliale pour séparer le tissu de l'hôte à partir de lumière de l'intestin. Des études récentes fournissent la preuve que la perturbation de la EhCPADH112 TJ en protéine de parasite est une condition préalable à E. invasion de histolytica qui est accompagné par un dysfonctionnement de la barrière épithéliale. Ainsi, l'analyse des mécanismes moléculaires impliqués dans TJ démontage pendant E. invasion de histolytica est d'une importance capitale pour améliorer notre compréhension de la pathogenèse amibiase. Cet article présente un modèle simple qui permet l'évaluation des interactions initiales hôte-pathogène et le potentiel d'invasion de parasites. Paramètres à analyser sont trésistance électrique ransepithelial, l'interaction de EhCPADH112 avec les récepteurs de surface épithéliales, changements dans l'expression et la localisation de marqueurs de jonction épithéliales et la localisation des molécules du parasite dans les cellules épithéliales.

Introduction

Entamoeba histolytica est un protozoaire responsable de l'amibiase humaine, une infection intestinale cellule causant l'inflammation et la diarrhée. E. histolytica infecte jusqu'à 50 millions de personnes chaque année, mais seulement 10% des personnes infectées développent les symptômes associés à l'amibiase ^1. L'infection se produit lors de l'ingestion d'aliments ou d'eau contaminés contenant E. kystes histolytica. Dans l'intestin, les kystes produisent trophozoïtes vivants qui adhèrent à côlon mucine et prolifèrent ^2. Trophozoïtes forment habituellement des kystes qui sont....

Protocol

1. Mise en place et entretien de E. Cultures histolytica

1. Cultivez axéniquement (entièrement libre de tous les autres organismes contaminants) 1 x 10 ⁵ trophozoïtes de la souche de Entamoeba histolytica HML: IMSS cloner un ¹⁸ en 16 x 125 tubes de culture en mm avec revêtement Téflon capsules à vis en ligne (ou 1 x 10 ⁶ trophozoïtes dans un jetable T- 25 flacon) et 15 ml (ou 50 ml en flacon T-25) de TYI-S-33 moyen (bouillon TYI complété avec 3% d'un mélange de diamant de la vitamine, 10% de sérum de chaleur de bovin adulte inactivé, 0,5 UI / ml de pénicilline et 35 pg / ml de streptomycine)

Results

Pour un succès E. culture histolytica, deux conditions importantes doivent être remplies: la croissance dans des conditions axéniques et récolte en phase logarithmique. Auparavant, les cultures de E. histolytica ont facilement créé en association avec certaines espèces de bactéries ou trypanosomatidés ^22. Cependant, de nos jours, il est courant d'avoir la culture axénique de ce parasite qui signifie une sous-culture indéfinie des amibes dans un environnement exempt de bactéries qui .......

Discussion

Afin d'étudier in vitro les interactions hôte-pathogène dans lors de l'infection par E. épithéliale histolytica, il est essentiel de travailler avec des cultures bien établies des deux cellules épithéliales et trophozoïtes. Par exemple, autrefois, E. cultures histolytica habituellement avaient été mis en place en association avec certaines espèces de bactéries ou trypanosomatidés ^22,23. Cependant, la co-culture de E. cultures histolyti.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Entamoeba histolytica HM1 :IMSS, Clone A  ;	Hôpital IMSS, Mexique	Sans/nombre	Trophozoites virulents18  ;
TYI bouillon	Becton, Dickinson and Company Merck Merck Merck J.T. Baker Reproquifin SIGMA-Aldrich SIGMA-Aldrich	211862 K35625437 626 21578 4873 3252-01 CAS 50-81-7 C7880 F-5879	3,45 % BBL Biosate peptone 58 mM glucose 39 mM NaCl 5 mM KH2PO4 6,5 mM K2HPO4 16,3 mM acide ascorbique 8,1 mM L-cystéine 0.1 mM citrate d’ammonium ferrique, ajuster le pH 6,819
bovin adulte	Microlab , Labs., Mex.	SU146	Utilisation à 10 % et inactivé à 56 ° ; C pour 30 min
Diamond  ; mélange de vitamines- Tween 80	In vitro	SR-07	Utilisation à 3 %
Pénicilline  ;	Au bord du lac,  ; Mé ;x.	34564SSA IV	0,5 UI/ml
Streptomycine  ;	Au bord du lac,  ; Mé ;x.	75757SSA IV	35 et micro ; g/ml
Pyrex 15 ml Tubes de culture à vis avec bouchons phénoliques doublés de PTFE	Corning-Pyrex	9826-16X	16 x 125 mm, capacité 15 ml et bouchons fabriqués à partir d’une formule spéciale résistante aux effets de la température
Plaques de culture cellulaire, 6 puits	Corning-Costar	3516	Plaques stériles, diamètre du puits 34,8 mm et surface de croissance 9,5 cm2.  ; Les anneaux sur le couvercle empêchent la contamination croisée
25 cm2 fiole de culture cellulaire	Corning-Costar	430168	Fioles à col incliné
MDCK (Madin Darby canine kidney) type I	American Type Culture Collection	CCL34	Cellules épithéliales rénales cultivées entre le 60th et le passage 90th
milieu DMEM  ;	Gibco  ;	12800-017	Dulbecco’s Modified Eagle Medium avec une teneur élevée en glucose.
Sérum de veau nouveau-né	In vitro	S-02	À utiliser à 10 %.  ;   ;
Mélange pénicilline/streptomycine  ;	In vitro  ;	A-01	Solution mère 10 000 U/µ ; g/ml
d’insuline  ;   ;	AMSA	398MJ94SSA IV	Solution mère 100 UI/ml
Solution de trypsine  ;	In vitro	EN-005	Solution enzymatique à 0,05 % sans calcium ni magnésium
75 cm2 fiole de culture cellulaire	Corning-Costar	430720	Fioles à col incliné pour la culture de trophozoïtes en milieu TYI-S-33
Supports perméables Transwell	Corning-Costar	3470	0,4 µ ; membrane polyster M, insert de 6,5 mm dans une plaque à 24 puits, surface de croissance 0,3 cm2
>Plat de culture cellulaire à 24 puits  ;   ;	Corning-Costar	3524	Polystyrène transparent, traité pour une fixation cellulaire optimale, stérilisé par rayonnement gamma et certifié apyrogène
Complete Mini Roche		11836 153 001	Le cocktail inhibiteur de protéase inhibe un large spectre de sérine, de cystéine et de métallo-protéases. Concentration finale 1 mM  ;
Trans-époxysuccinyl-L-leucylamido (4-guanidino) butane (E-64)	SIGMA-Aldrich	E3132	Inhibiteur de la cystéine protéase, concentration finale 40 µ ; g/ml
p&alpha ; ZO-1  ;	Invitrogen	402200	IgG anticorps policlonal de lapin contre un peptide synthétique dans la région médiane de la protéine humaine ZO-1
m&alpha ; EhCPADH112	Anticorps maison	Sans/Nombre	IgM de souris Anticorps monoclonal contre l’épitope 444-601 situé au niveau C-terminal d’EhCPADH11221,27
FITC-chèvre anti-souris Zymed		62-6811	Isotiocyanate de fluorescéine (FITC) chèvre anti-souris secondaire  ; anticorps
TRITC- chèvre anti-lapin IgG (H+L)	Zymed	816114	Marquage à l’isothiocyanate de tétraméthyl-rhodamine (TRITC)  ; chèvre anti-lapin IgG  ; anticorps secondaire.
Instrument de précision mondial d’électrodes STX2	;	102711	Se compose d’une paire fixe d’électrodes doubles, de 4 mm de large et 1 mm d’épaisseur. Chaque bâtonnet de la paire d’électrodes contient une pastille d’argent/chlorure d’argent pour la mesure de la tension et une électrode d’argent pour le passage du courant. À utiliser avec EVOM
Voltohmmètre épithélial EVOM	World Precision Instrument.	12111	Utilisation en mode résistance et maintien débranché pendant les mesures TER
Chambre Neubauer	MEARIENFELD	610610	Hémocytomètre  ;
Leica TCS_SP5_MO	Leica	Sans/numéro	Microscopie confocale laser avec Leica microsystems CMS Gmbh/leica Las af Lite/BIN software
Vectashield	Vector Laboratories, Inc.	H-1000	Milieu de montage pour fluorescence
4',6-diamino-2-phénylindole (Dapi)	SIGMA	D-9542	0,05 mM concentration finale
Albumine sérique bovine (BSA)	US Biological	A-1310	0,5 % Concentration finale pour solution bloquante