В естественных условиях клоновых Tracking гемопоэтических стволовых и клеток-предшественников оцениваться пятью флуоресцентных белков с помощью конфокальной и многофотонной микроскопии
Summary
Комбинаторные 5 флуоресцентные белки маркировки гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток позволяет в естественных условиях клонального отслеживания через конфокальной и двухфотонной микроскопии, обеспечивая понимание архитектуры кроветворной костного мозга во время регенерации. Этот метод позволяет неинвазивным отображение судьба спектрально-кодированных HSPCs-клеток, полученных в здоровых тканей для длительные периоды времени после трансплантации.
Abstract
Мы разработаны и утверждены флуоресцентной маркировки методологию клонального отслеживания гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) с высоким пространственным и временным разрешением на учебу в естественных условиях кроветворения помощью пересадки костного мозга экспериментальную модель мышиной кости. Генетическая комбинаторной маркировки с помощью лентивирусные векторы, кодирующие флуоресцентные белки (FPS) включен отображение клеточных судеб с помощью передовых изображений микроскопии. Векторы, кодирующие пять различных FPS: лазурный, EGFP, Венера, tdTomato, и mCherry были использованы для одновременно преобразовывать HSPCs, создавая разнообразный палитру цветных отмечены клеток. Изображений с помощью конфокальной / двухфотонного гибридный микроскопии обеспечивает одновременную оценку с высоким разрешением однозначно меченых клеток и их потомков в сочетании с структурных компонентов тканей. Объемный анализ на больших площадях, показывают, что спектрально кодированные HSPC-производные клетки могут быть обнаружены неинвазивно в различных здоровых тканей, в том числе костного мозга (BM), Для длительные периоды времени после трансплантации. Текущие исследования, сочетающие видео-курс многофотонное и конфокальной микроскопии покадровой в 4D показывают возможность динамического сотовой и клонального слежения в количественном выражении.
Introduction
Производство клеток крови, называемых кроветворения, поддерживается небольшой популяции гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs). Эти клетки находятся в костном мозге (ВМ) в комплексной микросреды нише, состоящей из остеобластов, стромальных клеток жировой ткани, и сосудистых структур, все участвуют в контроле самообновления и дифференцировки 1,2. Как нетронутыми BM была традиционно недоступны для прямых наблюдений, взаимодействия между HSPC и их микросреды во многом остается охарактеризованный в естественных условиях. Ранее мы установили методологию для визуализации 3D архитектуру неповрежденной BM с помощью конфокальной флуоресцентной и отражения микроскопии 3. Мы характеризуется расширение EGFP-отмеченных HSPCs в БМ, но использование только одного FP исключается анализ регенерации на клональной уровне. Совсем недавно мы использовали в своих интересах Лентивирусов Джин Онтология (LEGO) векторы конструктивно выражать этлюминесцентной белки (FPS) для эффективного отметить ячейки 4,5. Co-трансдукция HSPC с 3 или 5 векторов порождает разнообразную палитру комбинаторных цветах, что позволяет отслеживать несколько отдельных клонов HSPC.
Помечено HSPC в сочетании с новой технологией обработки изображений разрешено проследить индивидуальный HSPC самонаведения и приживление в BM облученных мышей. Lego векторы использовали для обозначения HSPC с 3 или 5 различных кадров в секунду (от Cerulean, EGFP, Венера, tdTomato и mCherry) и следовать их приживление в течение долгого времени на БР по конфокальной и 2-фотонной микроскопии, позволяя четкую визуализацию костей и другие матричные структуры, а отношение HSPC клонов с компонентами их микросреды. HSPC очищали, как линии передачи отрицательных клеток от мышей C57BL / 6 Б.М., трансдуцированных LEGO векторов, и реинфузии путем инъекции в хвостовую вену в миело-абляции конгенных мышах. Контролируя большие объемы грудины BM ткани мы визуализировали эндостальные приживление происходящих в началеРегенерации BM. Сотовые кластеры с разнообразной спектров цвета появились первоначально в непосредственной близости от кости и прогрессировала централизованно в течение долгого времени. Интересно, что после более чем 3 недели мозг состоял из макроскопических клоновых кластеров, предполагая распространение кроветворения, полученных от отдельных HSPCs непрерывно в костном мозге, а не широкого распространения HSPCs через кровоток. Был менее цвет разнообразие на поздних временных точках, предлагая трудности в трансдуцирующих долгосрочные заселения клетки с несколькими векторами.
Кроме того, HSPCs формируется кластеров в селезенке, орган также отвечает за кроветворение у мышей. HPSC полученных отдельные клетки могут быть решены в тимусе, лимфатических узлов, селезенки, печени, легких, сердца, кожи, скелетных мышцах, жировой ткани и почек, а также. 3D-изображения можно оценить качественно и количественно оценить распределение клеток с минимальными возмущениями тканях. Наконец, мы проиллюстрируемд целесообразность живых динамических исследований в 4D путем объединения резонансную многофотонное сканирования и конфокальной микроскопии покадровой. Эта методика позволяет неинвазивным высокого разрешения, многомерная судьбы клеток трассировку спектрально отмеченных населения клеток в их нетронутыми 3D архитектуры, что является мощным инструментом в изучении регенерации тканей и патологии.
Protocol
Representative Results
Discussion
Мы описываем здесь подробности мощного методологии недавно разработанной для отслеживания клонального клеток, сочетая большой разнообразие сгенерированный комбинаторной маркировки с 5FP-кодирования LEGO векторов и изображений с тандемной конфокальной и 2-фотонной микроскопии для дос?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
- Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral ‘gene ontology’ (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
