In vivo Klonale Sporing af hæmatopoietisk stamcelletransplantation og progenitorceller Præget af Fem fluorescerende proteiner ved hjælp af konfokal og multiphoton mikroskopi
Summary
Kombinatoriske 5 fluorescerende proteiner mærkning af hæmatopoietiske stamceller og stamceller muliggør in vivo klonal sporing via konfokal og to-foton mikroskopi, der giver indsigt i knoglemarv hæmatopoietisk arkitektur under regenerering. Denne metode giver non-invasiv skæbne kortlægning af spektralt-kodede HSPCs-afledte celler i intakte væv til meget lang tid efter transplantation.
Abstract
Vi udviklet og valideret en fluorescerende mærkning metode til klonal sporing af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPCs) med høj rumlig og tidslig opløsning til at studere in vivo hæmatopoiese ved hjælp af den murine knoglemarvstransplantation eksperimentel model. Genetisk kombinatorisk mærkning hjælp lentivirusvektorer koder for fluorescerende proteiner (fps) aktiveret celle skæbne kortlægning via avanceret mikroskopi billeddannelse. Vektorer, der koder fem forskellige FPS: Cerulean, EGFP, Venus, tdTomato og mCherry blev anvendt til samtidig at transducere HSPCs, at skabe en mangfoldig palet af farver markerede celler. Imaging hjælp konfokal / to-foton hybrid mikroskopi giver samtidig høj opløsning vurdering af entydigt mærket celler og deres afkom i forbindelse med strukturelle komponenter i vævene. Volumetrisk analyser over store områder viser, at spektralt kodede HSPC-afledte celler kan påvises non-invasivt i forskellige intakte væv, herunder knoglemarv (BM), For meget lang tid efter transplantation. Levende studier kombinerer video-rate multiphoton og konfokal time-lapse billeddannelse i 4D demonstrere muligheden for dynamiske cellulære og klonal sporing på en kvantitativ måde.
Introduction
Produktionen af blodlegemer, kaldet hematopoiese, vedligeholdes af en lille population af hæmatopoietiske stamceller og stamceller (HSPCs). Disse celler opholde sig knoglemarv (BM) i en kompleks microenvironmental niche, der består af osteoblaster, stromale celler, fedtvæv og vaskulære strukturer, alle impliceret i kontrollen af selvfornyelse og differentiering 1,2. Som intakt BM har traditionelt været utilgængelige for direkte observationer, samspillet mellem HSPC og deres mikromiljø stort set karakteriseret in vivo. Tidligere har vi etableret en metode til at visualisere 3D arkitektur intakt BM hjælp konfokal fluorescens og refleksion mikroskopi 3. Vi kendetegnet udvidelse af EGFP-mærket HSPCs i BM, men anvendelse af kun en enkelt FP udelukket analyse af regenerering på en klonal plan. For ganske nylig tog vi fordel af Lentiviral Gene ontologi (Lego) vektorer konstitutivt udtrykker fluorescent proteiner (fps) til effektivt at markere celler 4,5. Co-transduktion af HSPC med 3 eller 5 vektorer genererer en mangfoldig palet af kombinatoriske farver, tillader sporing af flere individuelle HSPC kloner.
Mærket HSPC kombineret med ny billedteknologi lov til at spore individuelle HSPC målsøgende og transplantation i BM af bestrålede mus. Lego vektorer blev brugt til at markere HSPC med 3 eller 5 forskellige bps (fra Cerulean, eGFP, Venus, tdTomato og mCherry), og følg deres transplantation gennem tiden i BM af konfokal og 2-foton mikroskopi, så klar visualisering af knogler og andre matrix strukturer, og forholdet mellem HSPC kloner til komponenter i deres mikromiljø. HSPC blev renset som afstamning negative celler fra C57BL / 6 mus BM, transduceret med LEGO-vektorer, og reinfunderet af haleveneinjektion i myelo-ablated kongene mus. Ved at overvåge store mængder af brystbenet BM væv visualiserede vi endosteale transplantation forekommer tidligt iBM regenerering. Celleklynger med forskellige farve spektre optrådte først i tæt nærhed til knoglen og skred centralt over tid. Interessant, efter mere end 3 uger marven bestod af makroskopiske klonale klynger, hvilket tyder på spredning af hæmatopoiese stammer fra individuelle HSPCs contiguously i marven, snarere end omfattende udbredelse af HSPCs via blodbanen. Der var mindre farve mangfoldighed på sene tidspunkter, hvilket tyder på vanskeligheder ved transduktion langsigtet genbefolkning celler med flere vektorer.
Desuden HSPCs dannede klynger i milten, et organ, også ansvarlig for hæmatopoiese i mus. HPSC-afledte individuelle celler kan løses i thymus, lymfeknuder, milt, lever, lunge, hjerte, hud, skeletmuskulatur, fedtvæv og nyrer så godt. 3D-billeder kan vurderes kvalitativt og kvantitativt at værdsætte fordelingen af celler med minimale forstyrrelser af vævene. Endelig vil vi illustrered muligheden for levende dynamiske studier i 4D ved at kombinere resonans scanning multiphoton og konfokal time-lapse billeddannelse. Denne metode gør det muligt for ikke-invasiv høj opløsning, multidimensionel celle-skæbne sporing af spektralt markerede celler populationer i deres intakte 3D arkitektur, der giver et stærkt værktøj i studiet af væv regenerering og patologi.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi beskriver her detaljerne i en kraftfuld metode nylig udarbejdet til klonal celle sporing, der kombinerer den store mangfoldighed genereres af kombinatorisk mærkning med 5FP-koder for Lego vektorer og billeddannelse med tandem konfokal og 2-foton mikroskopi for at opnå volumetrisk og dynamisk billeddannelse i levende væv. Dette udvidede brug af FP-baserede farvemarkering ved at optage konfokal spektral identitet i 5 "særskilte" 8-bit-kanaler. Således det relative forhold mellem Cerulean, EGFP, Venus, td…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Intramural Research Program of the National Heart, Lung, Blood Institute of the National Institutes of Health. We thank Boris Fehse (University Medical Center Hamburg-Eppendorf, Hamburg, Germany) for providing the five LeGO vector plasmids; Christian A. Combs and Neal S. Young (NHLBI, NIH) for discussions, support and encouragement throughout this study, and Andre LaRochelle (NHLBI, NIH) for assistance with tail vein injections.
Materials
| Production of viruses | |||
| LeGO-Cer2 | Addgene | 27338 | Expression of Cerulean |
| LeGO-G2 | Addgene | 25917 | Expression of eGFP |
| LeGO-V2 | Addgene | 27340 | Expression of Venus |
| LeGO-T2 | Addgene | 27342 | Expression of tdTomato |
| LeGO-C2 | Addgene | 27339 | Expression of mCherry |
| Calciumm Phosphate Transfection Kit | Sigma | CAPHOS-1KT | |
| Tissue culture dish | BD Falcon | 353003 | |
| IMDM | Gibco, Life Technology | 12440-053 | |
| Fetal Bovine Serum Heat Inactivated | Sigma | F4135-500ML | |
| Pen Strep Glutamine | Gibco, Life Technology | 10378-016 | |
| Centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 326823 | |
| SW28 Ultracentrifuge | Beckman Coulter | L60 | |
| Millex Syringe Driven Filter Unite (0.22um) | Millipore | SLGS033SS | |
| Mouse cell collection, purification, transduction and transplantation | |||
| ACK lysing buffer | Quality Biologicals Inc. | 118-156-101 | |
| Lineage Cell Depletion Kit (mouse) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-090-858 | |
| LS columns + tubes | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-306 | |
| Pre-Separation Filters (30um) | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-041-407 | |
| StemSpan SFEM serum-free medium for culture and expansion of hematopoietic cells (500mL) | StemCell Technologies Inc | 9650 | |
| murine IL-11 CF | R & D Systems Inc | 418-ML-025/CF | |
| recombinant murine SCF | RDI Division of Fitzgerald Industries Intl | RDI-2503 | |
| recombinant murine IL-3 | R & D Systems Inc | 403-ML-050 | |
| FLT-3 Ligand | Miltenyi Biotec Inc. USA | 130-096-480 | |
| 12-well plates, Costar | Corning Inc. | 3527 | |
| Retronectin | Takara Bio Inc | T100A/B | |
| Protamine Sulfate | Sigma | P-4020 | |
| Confocal and two-photon microscopy | |||
| DMEM | Lonza | 12-614F | |
| 1M Hepes | Cellgro, Mediatech Inc. | 25-060-CI | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-20-C | MatTek Corporation | P35G-0-20-C | |
| Glass bottom culture dish P35G-0-14-C | MatTek Corporation | P35G-0-14-C | |
| Nunc Lab-Tek Chambered Coverglass #1 Borosilicate coverglass; 4-well | Thermo Scientific | 155383 | |
| Leica TCS SP5 AOBS five channels confocal and multi-photon microscope | Leica Microsystems | ||
| Chameleon Vision II -TiSaph laser range 680-1080nm | Coherent | ||
| Chameleon Compact OPO laser range 1030-1350nm | Coherent | ||
| HCX-IRAPO-L 25x/0.95 NA water dipping objective (WD=2.5 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PLAPO-CS 20x/0.70 NA dry objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| HC-PL-IRAPO 40x/1.1NA water immersion objective (WD=0.6 mm) | Leica Microsystems | ||
| Imaris software version 7.6 | Bitplane |
References
- Lo Celso, ., C, D. T., Scadden, The haematopoietic stem cell niche at a glance. J Cell Sci. 124, 3529-3535 (2011).
- Lo Celso, C., et al. Live-animal tracking of individual haematopoietic stem/progenitor cells in their niche. Nature. 457, 92-96 (2009).
- Takaku, T., et al. Hematopoiesis in 3 dimensions human and murine bone marrow architecture visualized by confocal microscopy. Blood. 116, e41-e55 (2010).
- Malide, D., Metais, J. Y., Dunbar, C. E. Dynamic clonal analysis of murine hematopoietic stem and progenitor cells marked by 5 fluorescent proteins using confocal and multiphoton microscopy. Blood. 120, e105-e116 (2012).
- Weber, K., Mock, U., Petrowitz, B., Bartsch, U., Fehse, B. Lentiviral gene ontology (LeGO) vectors equipped with novel drug-selectable fluorescent proteins new building blocks for cell marking and multi-gene analysis. Gene Ther. 17, 511-520 (2010).
- Weber, K., Bartsch, U., Stocking, C., Fehse, B. A multicolor panel of novel lentiviral ‘gene ontology’ (LeGO) vectors for functional gene analysis. Mol Ther. 16, 698-706 (2008).
- Weber, K., et al. RGB marking facilitates multicolor clonal cell tracking. Nat Med. 17, 504-509 (2011).
- Lo Celso, ., Lin, C. P., Scadden, D. T. In vivo imaging of transplanted hematopoietic stem and progenitor cells in mouse calvarium bone marrow. Nature protocols. 6, 1-14 (2011).
- Kohler, A., et al. Altered cellular dynamics and endosteal location of aged early hematopoietic progenitor cells revealed by time-lapse intravital imaging in long bones. Blood. 114, 290-298 (2009).
- Campagnola, P. J., et al. Three-dimensional high-resolution second-harmonic generation imaging of endogenous structural proteins in biological tissues. Biophys J. 82, 493-508 (2002).
- Weigert, R., Sramkova, M., Parente, L., Amornphimoltham, P., Masedunskas, A. Intravital microscopy a novel tool to study cell biology in living animals. Histochem Cell Biol. 133, 481-491 (2010).
- Zhang, Y., et al. Mouse models of MYH9-related disease mutations in nonmuscle myosin II-A. Blood. 119, 238-250 (2012).
