Vurdere antisvampeaktivitet Isoleret alveolære makrofager ved konfokal mikroskopi
Summary
En metode til at evaluere evnen hos isolerede mus alveolære makrofager til at styre væksten af fagocyterede Aspergillus sporer ved konfokal mikroskopi.
Abstract
Lungerne er en grænseflade, hvor værtsceller er rutinemæssigt udsættes for mikrober og mikrobielle produkter. Makrofager er de første-line fagocytceller der støder inhalerede svampe og andre mikrober. Makrofager og andre immunceller genkende Aspergillus motiver af patogene anerkendelse receptorer og indlede nedstrøms inflammatoriske reaktioner. Fagocytten NADPH oxidase genererer reaktive ilt mellemprodukter (ROIs) og er afgørende for vært forsvar. Selv NADPH-oxidase er kritisk for den neutrofil-medierede værtsforsvar 1 – 3 betydningen af NADPH-oxidase i makrofager er ikke veldefineret. Målet med denne undersøgelse var at afgrænse specifikke rolle NADPH oxidase i makrofager i formidlingen vært forsvar mod A. fumigatus. Vi fandt, at NADPH-oxidase i alveolære makrofager kontrollerer væksten af fagocyterede A. fumigatus sporer 4.. Her beskriver vi en metode til at vurdere muligheden for mus enlveolar makrofager (AMS) til at styre væksten af fagocyteret Aspergillus sporer (konidier). Alveolære makrofager farves in vivo og ti dage senere isoleres fra mus ved bronchoalveolær lavage (BAL). Makrofager udpladet på dækglas og derefter podet med grønt fluorescerende protein (GFP)-udtrykkende A. fumigatus sporer. På bestemte tidspunkter, cellerne fikseret og antallet af intakte makrofager med fagocyterede sporer vurderes af konfokal mikroskopi.
Introduction
Makrofager er de første-line fagocytceller der støder inhalerede mikrober. Makrofager genkende Aspergillus motiver af patogene anerkendelse receptorer indtage og begrænse væksten af inhalerede sporer (konidier), og indlede inflammatoriske reaktioner. Fagocytten NADPH-oxidase konverterer molekylært oxygen til superoxid anion og nedstrøms reaktive oxygenmellemprodukter (ROIs). Kronisk granulomatøs sygdom (CGD) er en arvelig lidelse i NADPH oxidase præget af alvorlige bakterie-og svampeinfektioner og ved overdrevne inflammatoriske reaktioner.
Selv NADPH-oxidase er kritisk for den neutrofil-medierede værtsforsvar 1 – 3 betydningen af NADPH-oxidase i makrofager er ikke veldefineret. Tidligere undersøgelser har vist, at alveolære makrofager indtager og dræbe Aspergillus sporer, mens neutrofile hovedsagelig målrette hyfe fase 5.. Imidlertid har der været modstridende results med hensyn til den rolle, NADPH-oxidase i makrofag i at kontrollere væksten af A. fumigatus sporer 6, 7.
Målet med denne metode var at afgrænse specifikke rolle NADPH oxidase i makrofager i formidlingen vært forsvar mod A. fumigatus sporer. Vi fandt, at NADPH-oxidase i alveolære makrofager kontrollerer væksten af fagocyterede A. fumigatus sporer 4.. For de fleste nøje modellere værtens respons på inhalerede svampe, brugte vi alveolære makrofager høstes af bronchoalveolar udskylning fra stimulerede mus umiddelbart efter aflivningen. Brugen af isolerede alveolære makrofager muligt for os at fokusere på deres svampedræbende aktivitet i fravær af andre immunceller (f.eks rekrutterede neutrofiler), der forsvarer over for Aspergillus in vivo. I denne fremgangsmåde blev alveolære makrofager farvet in vivo før høst for således at minimere mængden af post harvest manipulation. </ P>
En anden fordel ved denne protokol er anvendelsen af en GFP-udtrykkende A. fumigatus stamme. Denne svamp udtrykker GFP fra konidie scene gennem hyfe scenen og har ikke behov for yderligere farvning. For at opnå billeder med mere detaljeret, valgte vi konfokal mikroskopi, der gør det muligt at genopbygningen af tredimensionale strukturer fra de opnåede billeder. Tredimensional rekonstruktion giver evnen til at differentiere mellem hyfer voksende omkring snarere end i eller gennem en makrofag. Konidier kan også være præcis skelnes som intracellulær versus ekstracellulære.
Protocol
Representative Results
Discussion
Med denne fremgangsmåde til ex vivo-analyse af den antifungale aktivitet af makrofager sammen med in vivo-svampe udfordring, vi tidligere vist, at NADPH-oxidase i makrofager spiller en vigtig rolle i forsvaret mod A. fumigatus 4.. Brugen af isolerede alveolære makrofager giver os mulighed for at fokusere på deres svampedræbende aktivitet i fravær af andre immunceller (f.eks rekrutterede neutrofiler), som forsvarer mod Aspergillus in vivo.
<p class="jove_co…Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af National Institute of Allergy og infektionssygdomme Grant R01AI079253 (til BHS) og af National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA016056 til Roswell Park Cancer Institute.
Materials
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| insulin syringes | |||
| 6 ml syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| scissors | |||
| forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
- Reeves, E. P., et al. Killing activity of neutrophils is mediated through activation of proteases by K+ flux. Nature. 416, 291-297 (2002).
- Bianchi, M., et al. Restoration of NET formation by gene therapy in CGD controls aspergillosis. Blood. 114, 2619-2622 (2009).
- Vethanayagam, R. R., et al. Role of NADPH oxidase versus neutrophil proteases in antimicrobial host defense. PLoS One. 6, (2011).
- Grimm, M. J., et al. Monocyte- and Macrophage-Targeted NADPH Oxidase Mediates Antifungal Host Defense and Regulation of Acute Inflammation in Mice. The Journal of Immunology. 190, 4175-4184 (2013).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. Selective protection against conidia by mononuclear and against mycelia by polymorphonuclear phagocytes in resistance to Aspergillus. Observations on these two lines of defense in vivo and in vitro with human and mouse phagocytes. J Clin Invest. 69, 617-631 (1982).
- Philippe, B., et al. Killing of Aspergillus fumigatus by alveolar macrophages is mediated by reactive oxidant intermediates. Infect Immun. 71, 3034-3042 (2003).
- Cornish, E. J., et al. Reduced nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase-independent resistance to Aspergillus fumigatus in alveolar macrophages. J Immunol. 180, 6854-6867 (2008).
- Jennings, J. H., Linderman, D. J., Hu, B., Sonstein, J., Curtis, J. L. Monocytes recruited to the lungs of mice during immune inflammation ingest apoptotic cells poorly. Am J Respir Cell Mol Biol. 32, 108-117 (2005).
- Davidson, B. A., et al. DISCRIMINATION OF RESIDENT AND INFILTRATED ALVEOLAR MACROPHAGES BY FLOW CYTOMETRY IN INFLUENZA A VIRUS-INFECTED MICE. Experimental Lung Research. 31, 323-339 (2005).
- Gelderman, K. A., et al. Macrophages suppress T cell responses and arthritis development in mice by producing reactive oxygen species. J Clin Invest. 117, 3020-3028 (2007).
- Pizzolla, A., et al. Reactive oxygen species produced by the NADPH oxidase 2 complex in monocytes protect mice from bacterial infections. J Immunol. 188, 5003-5011 (2012).
- Luther, K., et al. Characterisation of the phagocytic uptake of Aspergillus fumigatus conidia by macrophages. Microbes and Infection. 10, 175-184 (2008).
- Geunes-Boyer, S., et al. Surfactant Protein D Increases Phagocytosis of Hypocapsular Cryptococcus neoformans by Murine Macrophages and Enhances Fungal Survival. Infection and Immunity. 77, 2783-2794 (2009).
- García-Rodas, R., González-Camacho, F., Rodríguez-Tudela, J. L., Cuenca-Estrella, M., Zaragoza, O. The Interaction between Candida krusei and Murine Macrophages Results in Multiple Outcomes, Including Intracellular Survival and Escape from Killing. Infection and Immunity. 79, 2136-2144 (2011).
- Ryan, L. K., Vermeulen, M. W. Alveolar macrophages from C3H/HeJ mice show sensitivity to endotoxin. Am J Respir Cell Mol Biol. 12, 540-546 (1995).
- Redente, E. F., et al. Differential polarization of alveolar macrophages and bone marrow-derived monocytes following chemically and pathogen-induced chronic lung inflammation. J Leukoc Biol. 88, 159-168 (2010).
- Schaffner, A., Douglas, H., Braude, A. I., Davis, C. E. Killing of Aspergillus spores depends on the anatomical source of the macrophage. Infect Immun. 42, 1109-1115 (1983).
- Goodridge, H. S., et al. Differential use of CARD9 by dectin-1 in macrophages and dendritic cells. J Immunol. 182, 1146-1154 (2009).
