הערכת פעילות אנטי פטרייתי של מבודדים מכתשיים המקרופאגים ידי מיקרוסקופיה confocal

Summary

שיטה כדי להעריך את יכולתם של מקרופאגים מכתשיים עכבר בודדים לשלוט על הצמיחה של נבגי אספרגילוס phagocytosed ידי מיקרוסקופיה confocal.

Abstract

הריאות היא ממשק שבו תאי מארח נחשפים באופן שיגרתי לחיידקים ומוצרים של חיידקים. מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בפטריות בשאיפה וחיידקים אחרים. המקרופאגים ותאים אחרים של מערכת חיסון לזהות את המוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן וליזום תגובות דלקתיות במורד הזרם. מונואמין NADPH תא בלען מייצר ביניים חמצן מגיבים (ROIs) והוא קריטי להגנה מארחת. למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים ^{3 – 1,} את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מטרת המחקר הנוכחי הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א ' fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א 'phagocytosed fumigatus נבגי ^4. כאן אנו מתארים שיטה להערכת היכולת של עכברמקרופאגים lveolar (AMS) לשלוט על הצמיחה של נבגי phagocytosed אספרגילוס (נבגים). מקרופאגים מכתשיים הם מוכתמים בvivo ועשרה ימים לאחר מכן בודדו מעכברים על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית (BAL). המקרופאגים הם מצופים על coverslips זכוכית, ולאחר מכן זורעים עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) להביע א נבגי fumigatus. בזמנים שצוינו, תאים הם קבועים ומספר מקרופאגים שלמים עם נבגי phagocytosed נבחנים על ידי מיקרוסקופיה confocal.

Introduction

מקרופאגים מכתשיים הם תאי phagocytic הקו הראשון שנתקלים בחיידקים בשאיפה. המקרופאגים מכירים מוטיבים אספרגילוס על ידי קולטנים זיהוי הפתוגן, לבלוע ולהגביל את הצמיחה של נבגים בשאיפה (נבגים), וליזום תגובות דלקתיות. מונואמין NADPH התא בלען ממיר חמצן מולקולרי לאניון סופראוקסיד ביניים במורד הזרם חמצן מגיבים (ROIs). המחלה granulomatous כרונית (CGD) היא הפרעה תורשתית של מונואמין NADPH מתאפיין בזיהומים חיידקיים ופטרייתיים חמורים ועל ידי תגובות דלקתיות מוגזמות.

למרות מונואמין NADPH הוא קריטי להגנה מארחת בתיווך נויטרופילים ^{3 – 1,} את החשיבות של מונואמין NADPH במקרופאגים אינה מוגדרת היטב. מחקרים קודמים הראו כי מקרופאגים מכתשיים לבלוע ולהרוג נבגי אספרגילוס, בעוד שהנויטרופילים בעיקר למקד את שלב hyphal ^5. עם זאת, היו resul סותרts כלתפקיד של מונואמין NADPH במקרופאג בשליטה על הצמיחה של א ' fumigatus נבגי ^{6, 7.}

מטרתה של שיטה זו הייתה להתוות את התפקיד הספציפי של מונואמין NADPH במקרופאגים בתיווך הגנת מארחת נגד א ' נבגי fumigatus. מצאנו כי מונואמין NADPH במקרופאגים מכתשיים שולט על הצמיחה של א 'phagocytosed fumigatus נבגי ^4. למודל תגובת המארח לפטריות בשאיפה באופן הדוק ביותר, השתמשנו מקרופאגים מכתשיים שנקטפו על ידי שטיפה ברונכואלוואולרית מעכברי unstimulated הבא להקריב באופן מיידי. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים אפשרו לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם בהיעדרם של תאים חיסוניים אחרים (למשל נויטרופילים שגויסו,) שלהתגונן מפני אספרגילוס in vivo. בשיטה זו, מקרופאגים מכתשיים הוכתמו in vivo לפני קציר, כדי למזער את הכמות של מניפולציה לאחר קטיף. </ P>

יתרון נוסף לפרוטוקול זה הוא השימוש בא-GFP-לבטא זן fumigatus. פטרייה זו מבטאת GFP משלב הנבגים דרך שלב hyphal ואין לו צורך בצביעה נוספת. כדי להשיג תמונות עם פירוט רב יותר, בחרנו מיקרוסקופיה confocal המאפשרת הבנייה מחדש של מבנים תלת ממדיים מהתמונות שהושגו. שחזור תלת ממדי נותן את היכולת להבדיל בין העובש גדל בסביבה ולא באו באמצעות מקרופאג. נבגים יכולים להיות גם בדיוק מכובדים כתאי לעומת תאי.

Protocol

כל ההליכים שבוצעו בבעלי חיים במחקר זה אושרו על ידי ועדת הטיפול בבעלי חיים והשימוש בRoswell Park Cancer Institute ועמדו בכל המדינה, הפדרלית, והמכון הלאומי לתקנות בריאות. 1. בvivo Macrophage תיוג הערה: PHK26 הוא צב?…

Representative Results

איסוף מקרופאג מכתשיים ידי BAL מעכברי unstimulated יגרום> 95% מאוכלוסייה טהורה המבוססת על ציטולוגיה. 3 ו 7 שעות (איור 2) נקודות זמן להקדים את שלב hyphal של פטרייתי צמיחה ולאפשר השוואה של יעילות phagocytic של נבגים בין גנוטיפים. נקודת הזמן 14 שעות היא שבו ניתן להשוות גנוטיפים …

Discussion

השימוש בגישה זו לניתוח vivo לשעבר של הפעילות נגד פטריות של מקרופאגים יחד עם אתגר פטרייתי in vivo, שהוכחנו בעבר כי מונואמין NADPH במקרופאגים ממלא תפקיד חשוב בהגנה מפני א ⁴ fumigatus. שימוש במקרופאגים מכתשיים מבודדים מאפשרים לנו להתמקד בפעילות נגד פטריות שלהם ?…

Materials

PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4CL	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
insulin syringes
6 ml syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 micron Cell Strainers	BD Falcon	64753-00
scissors
forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell Culture Incubator			37 °C, 5%  CO2
22X22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6 well Cell Culture Plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope