공 초점 현미경으로 고립 된 폐포 대 식세포의 반대로 곰팡이 활동을 평가
Summary
공 초점 현미경에 의해 포식 누룩 곰팡이 포자의 성장을 제어하는 절연 쥐 폐포 대식 세포의 능력을 평가하는 방법.
Abstract
폐는 숙주 세포가 정기적으로 미생물 및 미생물 제품에 노출되는 인터페이스입니다. 폐포 대 식세포는 흡입 버섯 및 기타 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포 등 면역 세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식하고 다운 스트림 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 활성 산소 중간체 (로아)을 생성 및 호스트 방어에 중요합니다. NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 – 1 (3), 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이 연구의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 4 포자. 여기서, 우리는 마우스의 능력을 평가하는 방법을 서술포식 누룩 곰팡이 포자 (분 생자)의 성장을 제어하기 lveolar 식세포 (AMS). 폐포 대식 세포는 생체 내에서 스테인드 및 10 일 후 기관지 폐포 세척액 (BAL)에 의해 생쥐에서 격리됩니다. 대 식세포는 유리 커버 슬립에 도금되어, 다음 녹색 형광 단백질 (GFP)을 발현 A.을 시드 미가 투스 포자. 지정된 시간에, 세포를 고정 및 포식 포자 그대로 식세포의 수는 공 초점 현미경에 의해 평가된다.
Introduction
폐포 대 식세포는 흡입 미생물 처음 나올 줄 식세포의 세포입니다. 대 식세포는 병원체 인식 수용체에 의해 아스 페르 길 루스 모티브를 인식 섭취 및 흡입 포자 (분생 포자)의 성장을 제한하고 염증 반응을 시작합니다. 식세포의 NADPH 산화 효소는 슈퍼 옥사이드 음이온 및 다운 스트림 활성 산소 중간체 (로아)에 산소 분자를 변환합니다. 만성 육아 종성 질환 (CGD)는 심각한 세균 및 곰팡이 감염에 의해 과도한 염증 반응이 특징 NADPH 산화 효소의 유전 질환이다.
NADPH 산화 효소가 중요하지만 호중구 매개 숙주 방어 – 1 (3), 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 중요성은 잘 정의되어 있지 않습니다. 이전 연구는 호중구가 주로 균사의 단계 5를 대상으로하는 반면 폐포 대 식세포가 섭취 및 아스 페르 길 루스 포자를 죽이는 것으로 나타났습니다. 그러나, 충돌 resul가 있었다A.의 성장을 억제하는 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 역할에 같은 TS 미가 투스는 6, 7, 포자.
이 방법의 목적은 A.에 대한 숙주 방어를 매개로 대 식세포의 NADPH 산화 효소의 특정 역할을 묘사했다 미가 투스 포자. 우리는 폐포 대 식세포에서 NADPH 산화 효소가 포식 A.의 성장을 제어하는 것을 발견 미가 투스 4 포자. 가장 밀접하게 흡입 곰팡이에 대한 호스트 응답을 모델링하기 위해, 우리는 비자극 마우스에서 바로 희생 다음과 같은 기관지 세척하여 수확 폐포 대 식세포를 사용했습니다. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 모집 호중구)의 부재에 자신의 항진균 활성에 초점을 할 수있었습니다. 이 방법에서는, 폐포 대 식세포가 수확 후 조작의 양을 최소화하기 위해 수확 전에 생체 내에서 염색 하였다. </ P>
이 프로토콜의 또 다른 장점은 GFP-발현 A.의 사용이다 미가 투스의 변형. 이 균류는 균사의 단계를 통해 포자 단계에서 GFP를 표현하고 추가 염색에 대한 필요가 없습니다. 더 상세한 이미지를 얻으려면, 우리는 얻은 이미지로부터 3 차원 구조의 재구성을 가능하게 공 초점 현미경을 선택했다. 입체 재건 균사가 대 식세포 또는 통해 주위에 성장보다는 구별 할 수있는 기능을 제공합니다. 분생 포자는 세포 대 세포로 정확하게 구별 할 수 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
함께 생체 진균 챌린지와 대 식세포의 항균 활성의 생체 외 분석을 위해 이러한 접근법을 사용하여, 우리는 이전 식세포의 NADPH 산화 효소는 A. 방어에서 중요한 역할을한다는 것을 입증 미가 투스 4. 고립 된 폐포 대 식세포의 사용은 생체 내에서 아스 페르 길 루스에 대한 방어 다른 면역 세포 (예를 들어, 호중구 모집)의 부재에서 자신의 항진균 활…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 알레르기의 국립 연구소와 전염병 부여 R01AI079253 (BHS까지)에 의해 지원되었다에게 국립 암 연구소 암 센터 지원 그랜트 CA016056 로즈웰 파크 암 연구소에.
Materials
| PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
| 2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
| 2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
| NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
| 22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
| insulin syringes | |||
| 6 ml syringes | |||
| 4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
| suture thread | |||
| 50 ml conical centrifuge tubes | |||
| gauze sponges (4 inch square) | |||
| RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
| Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
| Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
| Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
| Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
| Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
| 100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
| scissors | |||
| forceps | |||
| Biological Safety Cabinet Class II | |||
| Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
| Leica DM1000 light microscope | |||
| Hemocytometer | |||
| Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
| Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
| 22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
| 6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
| Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |
References
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