Vurdere Anti-sopp aktivitet av isolerte alveolære makrofager ved konfokalmikroskopi

Summary

En fremgangsmåte for å evaluere evnen av isolerte mus alveolære makrofager til å kontrollere veksten av fagocytterte Aspergillus spores ved konfokal mikroskopi.

Abstract

Lungene er et grensesnitt der vertsceller blir rutinemessig utsatt for mikrober og mikrobielle produkter. Alveolære makrofager er de første linjer fagocytiske celler som møter inhalert sopp og andre mikrober. Makrofager og andre immunceller gjenkjenne Aspergillus motiver etter patogen anerkjennelse reseptorer og initiere nedstrøms inflammatoriske responser. Den phagocyte NADPH oksidase genererer reaktive oksygen mellomprodukter (Rois) og er kritisk for host forsvar. Selv om NADPH oksidase er kritisk for nøytrofil-mediert vertsforsvar ^{1 – 3,} er betydningen av NADPH oksidase i makrofager er ikke godt definert. Målet med denne studien var å avgrense den spesifikke rolle NADPH oksidase i makrofager i formidling host forsvar mot A. fumigatus. Vi fant ut at NADPH oksidase i alveolære makrofager styrer veksten av phagocytosed A. fumigatus spores ^fire. Her beskriver vi en fremgangsmåte for å vurdere muligheten for en muslveolar makrofager (AMS) for å kontrollere veksten av phagocytosed Aspergillus sporer (conidia). Alveolære makrofager er farget in vivo og ti dager senere isolert fra mus ved bronchoalveolar lavage (BAL). Makrofager er belagt på glass dekkglass, deretter sådd med grønt fluorescerende protein (GFP)-uttrykke A. fumigatus sporer. På bestemte tidspunkter, blir cellene fiksert og antall intakte makrofager med fagocytterte sporer vurderes av konfokalmikroskopi.

Introduction

Alveolære makrofager er de første linjer fagocytiske celler som møter inhalerte mikrober. Makrofager gjenkjenner Aspergillus motiver etter patogen anerkjennelse reseptorer, svelges og begrense veksten av inhalert sporer (conidia), og sette i gang betennelsesreaksjoner. Den phagocyte NADPH oksidase konverterer molekylært oksygen til superoksydanion og nedstrøms reaktive oksygen mellomprodukter (Rois). Kronisk granulomatøs sykdom (CGD) er en arvelig lidelse av NADPH oksidase preget av alvorlige bakterie-og soppinfeksjoner, og ved overdreven inflammatoriske responser.

Selv om NADPH oksidase er kritisk for nøytrofil-mediert vertsforsvar ^{1 – 3,} er betydningen av NADPH oksidase i makrofager er ikke godt definert. Tidligere studier har vist at alveolære makrofager svelges og drepe Aspergillus sporer, mens nøytrofile hovedsakelig rettet mot hyphal scenen ^fem. Imidlertid har det vært motstridende results som til rollen som NADPH oksidase i makrofag til å kontrollere veksten av A. fumigatus spores ^{6, 7.}

Målet med denne metoden var å avgrense den spesifikke rolle NADPH oksidase i makrofager i formidling host forsvar mot A. fumigatus sporer. Vi fant ut at NADPH oksidase i alveolære makrofager styrer veksten av phagocytosed A. fumigatus spores ^fire. Til tettest modelverts respons på inhalert sopp, brukte vi alveolære makrofager høstes av bronchoalveolar kylling fra unstimulated mus umiddelbart etter offer. Bruken av isolerte alveolære makrofager aktivert oss til å fokusere på sine soppdrepende aktivitet i fravær av andre immunceller (f.eks rekruttert nøytrofile), som beskytter mot Aspergillus in vivo. I denne fremgangsmåten, ble det alveolære makrofager farget in vivo før høsting, slik som å minimalisere mengden av etter innhøsting manipulasjon. </ P>

En annen fordel med denne protokoll er bruken av et GFP-uttrykk A. fumigatus belastning. Denne soppen uttrykker GFP fra conidial scenen gjennom hyphal scenen og har ikke behov for ytterligere misfarging. For å oppnå bilder med større detalj, valgte vi konfokal mikroskopi som muliggjør rekonstruksjon av tredimensjonale strukturer fra de oppnådde bildene. Tredimensjonal rekonstruksjon gir muligheten til å skille mellom hyfer vokser rundt stedet for i eller gjennom en makrofag. Conidia kan også være nettopp erklæres som intracellulær versus ekstracellulært.

Protocol

Alle prosedyrer utført på dyr i denne studien ble godkjent av Animal Care og bruk komité ved Roswell Park Cancer Institute og overholdt alle statlige, føderale og National Institutes of Health forskrifter. En. In vivo Macrophage Merking Merk: PHK26 er et lipofilt fargestoff som vil bli tatt opp av fagocytiske celler i både sirkulasjon og i vev når gitt intravenøst ​​(iv). PKH26 ble benyttet for in vivo merking for å minimere mengden av…

Representative Results

Samle alveolære makrofager etter BAL fra ustimulerte mus vil resultere i en> 95% ren populasjon basert på cytologi. Den 3 og 7 timer (figur 2) tidspunkt forut for hyphal stadium av soppvekst, og gi rom for en sammenligning av fagocytisk effektiviteten av conidia blant genotyper. Den 14-timers tidspunktet er der genotyper kan sammenlignes med hensyn til evnen til å hemme overgangen av phagocytosed conidia på vev-invasiv hyphal trinn (figur 3). Intakt makrofag kan identifiser…

Discussion

Ved hjelp av denne metode for ex vivo analyse av antifungal aktivitet av makrofager sammen med in vivo sopp utfordring, vi tidligere demonstrert at NADPH oksidase i makrofager spiller en viktig rolle i forsvaret mot A. fumigatus ^fire. Bruken av isolerte alveolære makrofager gjør oss i stand til å fokusere på sine soppdrepende aktivitet i fravær av andre immunceller (f.eks rekruttert nøytrofile), som beskytter mot Aspergillus in vivo.

<p class="jove_conten…

Materials

PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4CL	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
insulin syringes
6 ml syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 micron Cell Strainers	BD Falcon	64753-00
scissors
forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell Culture Incubator			37 °C, 5%  CO2
22X22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6 well Cell Culture Plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope