Avaliar a atividade anti-fúngica isolada de macrófagos alveolares por microscopia confocal

Summary

Um método para avaliar a capacidade dos isolados macrófagos alveolares do rato para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados por microscopia confocal.

Abstract

O pulmão é uma interface em que as células hospedeiras são rotineiramente expostas a microorganismos e produtos microbianos. Macrófagos alveolares são células fagocíticas de primeira linha que encontram fungos inalados e outros micróbios. Os macrófagos e outras células do sistema imunológico reconhecem motivos Aspergillus por receptores de reconhecimento de patógenos e iniciar respostas inflamatórias a jusante. A NADPH oxidase de fagócitos gera intermediários reativas de oxigênio (ROIs) e é fundamental para a defesa do hospedeiro. Apesar de NADPH-oxidase é crítica para a defesa do hospedeiro mediada pelos neutrófilos ^1-3, a importância da NADPH-oxidase em macrófagos não está bem definido. O objetivo deste estudo foi delinear o papel específico da NADPH oxidase em macrófagos na mediação de defesa do hospedeiro contra A. fumigatus. Descobrimos que a NADPH oxidase de macrófagos alveolares controla o crescimento de A. fagocitado fumigatus esporos ^4. Aqui, descrevemos um método para avaliar a capacidade de um ratomacrófagos lveolar (AMS) para controlar o crescimento de esporos de Aspergillus fagocitados (conídios). Macrófagos alveolares são coradas in vivo e dez dias mais tarde isolado a partir de murganhos por lavagem broncoalveolar (BAL). Os macrófagos são semeadas em lamínulas de vidro, então semeado com a proteína verde fluorescente (GFP) expressando A. esporos fumigatus. Em momentos específicos, as células são fixadas e o número de macrófagos intactas com esporos fagocitados é avaliada por microscopia confocal.

Introduction

Macrófagos alveolares são as células fagocíticas de primeira linha que encontram micróbios inalados. Os macrófagos reconhecem motivos Aspergillus por receptores de reconhecimento de patógenos, ingerir e limitar o crescimento de esporos inalados (conídios), e iniciar as respostas inflamatórias. A NADPH oxidase de fagócitos converte oxigênio molecular ao ânion superóxido e intermediários reativas de oxigênio a jusante (ROIs). A doença granulomatosa crônica (CGD) é uma desordem hereditária do sistema NADPH oxidase caracterizada por infecções bacterianas e fúngicas graves e por respostas inflamatórias excessivas.

Apesar de NADPH-oxidase é crítica para a defesa do hospedeiro mediada pelos neutrófilos ^1-3, a importância da NADPH-oxidase em macrófagos não está bem definido. Estudos anteriores mostraram que os macrófagos alveolares ingerir e matar os esporos de Aspergillus, enquanto que os neutrófilos como alvo principalmente o estágio de hifas ^5. No entanto, tem havido resul conflitantests quanto ao papel da NADPH-oxidase em macrófagos para controlar o crescimento de A. fumigatus esporos ^{6, 7.}

O objetivo deste método foi delinear o papel específico da NADPH oxidase em macrófagos na mediação de defesa do hospedeiro contra A. esporos fumigatus. Descobrimos que a NADPH oxidase de macrófagos alveolares controla o crescimento de A. fagocitado fumigatus esporos ^4. Para modelar mais de perto a resposta do hospedeiro a fungos inalados, usamos macrófagos alveolares colhidas por lavagem broncoalveolar de camundongos não estimuladas imediatamente após o sacrifício. O uso de macrófagos alveolares isolados nos permitiu concentrar em sua atividade antifúngica, na ausência de outras células do sistema imunológico (por exemplo, neutrófilos recrutados) que defendem contra Aspergillus in vivo. Neste método, os macrófagos alveolares foram coradas in vivo antes da colheita de modo a minimizar a quantidade de manipulação de pós-colheita. </ P>

Outra vantagem do presente protocolo é a utilização de um expressando GFP-A. fumigatus tensão. Este fungo expressa GFP a partir da fase de conídios através da fase de hifas e não tem necessidade de uma maior coloração. Para obter imagens com maior detalhe, escolhemos microscopia confocal que permite a reconstrução de estruturas tridimensionais a partir de imagens obtidas. A reconstrução tridimensional dá a capacidade de diferenciar entre hifas em torno, em vez de em ou através de um macrófago. Os conídios também pode ser justamente distinguido como intracelular contra extracelular.

Protocol

Todos os procedimentos realizados em animais neste estudo foram aprovados pelo Comitê Animal Care e Use em Roswell Park Cancer Institute e cumpriu todo o estado, federal, e os Institutos Nacionais de Saúde regulamentos. 1. In vivo macrófago Labeling Nota: PHK26 é um corante lipofílico que serão absorvidos pelas células fagocíticas, tanto na circulação e nos tecidos quando administrados por via intravenosa (iv). PKH26 foi utilizado para a etiqueta…

Representative Results

A recolha dos macrófagos alveolares pelo LBA de ratinhos não estimulados irá resultar numa população pura de> 95% com base na citologia. A 3 e 7 horas (Figura 2) pontos de tempo preceder a fase de hifas de crescimento fúngico e permitir uma comparação da eficiência fagocítica de conídios entre genótipos. O ponto de tempo de 14 horas é onde genótipos pode ser comparado no que respeita à capacidade para inibir a passagem de conídios fagocitado para a fase de hifas tecido invasiva …

Discussion

Utilizando esta abordagem de análise ex vivo da actividade antifúngica de macrófagos in vivo juntamente com o desafio de fungos, que anteriormente demonstrou que a NADPH oxidase nos macrófagos desempenha um papel importante na defesa contra A. fumigatus ^4. A utilização de macrófagos alveolares isolados nos permite focar a sua actividade anti-fúngica, na ausência de outras células do sistema imune (por exemplo, recrutamento de neutrófilos) que protegem contra o <e…

Materials

PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4CL	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
insulin syringes
6 ml syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 micron Cell Strainers	BD Falcon	64753-00
scissors
forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell Culture Incubator			37 °C, 5%  CO2
22X22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6 well Cell Culture Plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope