Bedöma Antifungal aktivitet av isolerat alveolära makrofager av konfokalmikroskopi

Summary

En metod för att utvärdera förmågan hos isolerade mus alveolära makrofager för att kontrollera tillväxten av fagocyterade Aspergillus sporer genom konfokalmikroskopi.

Abstract

Lungan är ett gränssnitt där värdceller används rutinmässigt exponeras för mikrober och mikrobiella produkter. Alveolära makrofager är första linjens fagocytceller som stöter inhalerade svampar och andra mikrober. Makrofager och andra immunceller känner igen Aspergillus motiv av patogener erkännande receptorer och initiera nedströms inflammatoriska svar. Den fagocytsystemet NADPH-oxidas genererar reaktiva syremellanprodukter (ROI), och är avgörande för värdförsvar. Trots att NADPH-oxidas är avgörande för neutrofilmedierad värdförsvar ^{1 – 3,} vikten av NADPH-oxidas i makrofager är inte väl definierad. Målet med denna studie var att beskriva den särskilda roll som NADPH-oxidas i makrofager i att medla värdförsvar mot A. fumigatus. Vi fann att NADPH-oxidas i alveolära makrofager styr tillväxten av fagocyteras A. fumigatus sporer ^4. Här beskriver vi en metod för att bedöma förmågan hos mus-alveolar makrofager (AMS) för att kontrollera tillväxten av fagocyteras Aspergillus sporer (konidier). Alveolära makrofager färgades in vivo och tio dagar senare isolerades från möss genom bronkoalveolär lavage (BAL). Makrofager stryks ut på täckglas av glas, ympades sedan med grönt fluorescerande protein (GFP)-uttryckande S. fumigatus-sporer. Vid bestämda tidpunkter, celler fasta och antalet intakta makrofager med fagocyterade sporer bedöms av konfokalmikroskopi.

Introduction

Alveolära makrofager är första linjens fagocytceller som stöter inhalerade mikrober. Makrofager erkänna Aspergillus motiv genom patogenfria igenkänningsreceptorer ingest och begränsa tillväxten av inhalerade sporer (konidier), och initiera inflammatoriska responser. Den fagocytsystemet NADPH-oxidas omvandlar molekylärt syre till superoxidanjon och nedströms reaktiva syre intermediärer (ROI). Kronisk granulomatös sjukdom (CGD) är en ärftlig sjukdom i NADPH-oxidas med allvarliga bakterie-och svampinfektioner samt genom överdrivna inflammatoriska svar.

Trots att NADPH-oxidas är avgörande för neutrofilmedierad värdförsvar ^{1 – 3,} vikten av NADPH-oxidas i makrofager är inte väl definierad. Tidigare studier har visat att alveolära makrofager äter och döda Aspergillus sporer, medan neutrofiler huvudsakligen rikta hyfal etapp ^5. Däremot har det funnits motstridiga Results som till rollen av NADPH-oxidas i makrofager i att kontrollera tillväxten av A. fumigatus sporer ^{6, 7.}

Målet med denna metod var att avgränsa den särskilda roll som NADPH-oxidas i makrofager i att medla värdförsvar mot A. fumigatus-sporer. Vi fann att NADPH-oxidas i alveolära makrofager styr tillväxten av fagocyteras A. fumigatus sporer ^4. För närmast modelvärd svar på inhalerade svampar, använde vi alveolära makrofager skördas av lungsköljning från ostimulerade möss omedelbart efter offer. Användningen av isolerade alveolära makrofager möjligt för oss att fokusera på sin svampdödande aktivitet i frånvaro av andra immunceller (t.ex. rekryterade neutrofiler) som försvarar mot Aspergillus in vivo. Vid denna metod var alveolära makrofager färgades in vivo före skörd för att minimera mängden av efter skörd manipulation. </ P>

En annan fördel med detta protokoll är användningen av en GFP-uttryckande S. fumigatus stam. Denna svamp uttrycker GFP från konidiala stadiet genom hyfal ledet och har inget behov av ytterligare färgning. För att erhålla bilder med större detalj, valde vi konfokalmikroskopi som möjliggör rekonstruktion av tredimensionella strukturer från de erhållna bilderna. Tredimensionell rekonstruktion ger förmågan att differentiera mellan hyfer växer runt i stället för i eller genom en makrofag. Konidier kan också vara exakt särskiljas som intracellulär kontra extracellulärt.

Protocol

Alla ingrepp på djur i denna studie har godkänts av Animal Care och användning kommittén vid Roswell Park Cancer Institute och uppfyllt alla statliga, federala, och National Institutes of Health föreskrifter. 1. In vivo Makrofag Märkning Anm: PHK26 är en lipofil färg som kommer att tas upp av fagocytiska celler både i omlopp och i vävnaderna när de administreras intravenöst (iv). PKH26 användes för in vivo-märkning för att minimera…

Representative Results

Samla alveolär makrofag från BAL från ostimulerade möss kommer att resultera i en> 95% ren population baserat på cytologi. Den 3 och 7 timmar (figur 2) tidpunkter föregå hyfal skede av svamptillväxt och möjliggöra en jämförelse av fagocytisk effektivitet konidier bland genotyper. Den 14 hr tidpunkt är där genotyper kan jämföras med avseende på förmåga att inhibera omvandling av fagocyteras konidier till vävnaden-invasiv hyfal steg (fig 3). Intakt makrofag ka…

Discussion

Med användning av denna metod för ex vivo-analys av den antifungala aktiviteten hos makrofager tillsammans med in vivo-fungal utmaning, som tidigare visade vi att NADPH-oxidas i makrofager spelar en viktig roll i försvaret mot A. fumigatus ^4. Användningen av isolerade alveolära makrofager gör att vi kan fokusera på sin svampdödande aktivitet i frånvaro av andra immunceller (t.ex. rekryterade neutrofiler) som försvarar mot Aspergillus in vivo.

<p class…

Materials

PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling	Sigma	PKH26GL-1KT
2,2,2 Tribromoethanol	Sigma	T48402	Used to make AvertinAnesthetic
2-methyl-2-butanol	Sigma	A-1685	Used to make AvertinAnesthetic
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium)	Corning	21-031-CV
NH4CL	Sigma	A0171	Used to make ACK red cell lysis buffer
KHCO3	Sigma	P91444	Used to make ACK red cell lysis buffer
EDTA	Sigma	E6758	Used to make ACK red cell lysis buffer
22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter	BD	381523	Insyte Autoguard Winged
insulin syringes
6 ml syringes
4-way stopcock	Fisher Scientific	50-700-077
suture thread
50 ml conical centrifuge tubes
gauze sponges (4 inch square)
RPMI 1640 with L-glutamine	Corning	10-040-CV
Fetal Bovine Serum	Hyclone	SH30396.03	heat inactivated
Hema 3 Stain Set	Fisher Scientific	22-122-911
Cytoseal 60	Thermo Scientific	8310-4
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants	BD	297252
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein			provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada
100 micron Cell Strainers	BD Falcon	64753-00
scissors
forceps
Biological Safety Cabinet Class II
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor
Leica DM1000 light microscope
Hemocytometer
Cytospin 2 centrifuge	Thermo Scientific
Cell Culture Incubator			37 °C, 5%  CO2
22X22 mm micro cover glass	VWR	48366-227	glass coverslips
6 well Cell Culture Plates	Corning	3506
10% Neutral Buffered Formalin	VWR	BDH0502-1LP
Vectashield Mounting medium with DAPI	Vector Laboratories	H-1200
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner			Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope