En metod för att utvärdera förmågan hos isolerade mus alveolära makrofager för att kontrollera tillväxten av fagocyterade Aspergillus sporer genom konfokalmikroskopi.
Lungan är ett gränssnitt där värdceller används rutinmässigt exponeras för mikrober och mikrobiella produkter. Alveolära makrofager är första linjens fagocytceller som stöter inhalerade svampar och andra mikrober. Makrofager och andra immunceller känner igen Aspergillus motiv av patogener erkännande receptorer och initiera nedströms inflammatoriska svar. Den fagocytsystemet NADPH-oxidas genererar reaktiva syremellanprodukter (ROI), och är avgörande för värdförsvar. Trots att NADPH-oxidas är avgörande för neutrofilmedierad värdförsvar 1 – 3, vikten av NADPH-oxidas i makrofager är inte väl definierad. Målet med denna studie var att beskriva den särskilda roll som NADPH-oxidas i makrofager i att medla värdförsvar mot A. fumigatus. Vi fann att NADPH-oxidas i alveolära makrofager styr tillväxten av fagocyteras A. fumigatus sporer 4. Här beskriver vi en metod för att bedöma förmågan hos mus-alveolar makrofager (AMS) för att kontrollera tillväxten av fagocyteras Aspergillus sporer (konidier). Alveolära makrofager färgades in vivo och tio dagar senare isolerades från möss genom bronkoalveolär lavage (BAL). Makrofager stryks ut på täckglas av glas, ympades sedan med grönt fluorescerande protein (GFP)-uttryckande S. fumigatus-sporer. Vid bestämda tidpunkter, celler fasta och antalet intakta makrofager med fagocyterade sporer bedöms av konfokalmikroskopi.
Alveolära makrofager är första linjens fagocytceller som stöter inhalerade mikrober. Makrofager erkänna Aspergillus motiv genom patogenfria igenkänningsreceptorer ingest och begränsa tillväxten av inhalerade sporer (konidier), och initiera inflammatoriska responser. Den fagocytsystemet NADPH-oxidas omvandlar molekylärt syre till superoxidanjon och nedströms reaktiva syre intermediärer (ROI). Kronisk granulomatös sjukdom (CGD) är en ärftlig sjukdom i NADPH-oxidas med allvarliga bakterie-och svampinfektioner samt genom överdrivna inflammatoriska svar.
Trots att NADPH-oxidas är avgörande för neutrofilmedierad värdförsvar 1 – 3, vikten av NADPH-oxidas i makrofager är inte väl definierad. Tidigare studier har visat att alveolära makrofager äter och döda Aspergillus sporer, medan neutrofiler huvudsakligen rikta hyfal etapp 5. Däremot har det funnits motstridiga Results som till rollen av NADPH-oxidas i makrofager i att kontrollera tillväxten av A. fumigatus sporer 6, 7.
Målet med denna metod var att avgränsa den särskilda roll som NADPH-oxidas i makrofager i att medla värdförsvar mot A. fumigatus-sporer. Vi fann att NADPH-oxidas i alveolära makrofager styr tillväxten av fagocyteras A. fumigatus sporer 4. För närmast modelvärd svar på inhalerade svampar, använde vi alveolära makrofager skördas av lungsköljning från ostimulerade möss omedelbart efter offer. Användningen av isolerade alveolära makrofager möjligt för oss att fokusera på sin svampdödande aktivitet i frånvaro av andra immunceller (t.ex. rekryterade neutrofiler) som försvarar mot Aspergillus in vivo. Vid denna metod var alveolära makrofager färgades in vivo före skörd för att minimera mängden av efter skörd manipulation. </ P>
En annan fördel med detta protokoll är användningen av en GFP-uttryckande S. fumigatus stam. Denna svamp uttrycker GFP från konidiala stadiet genom hyfal ledet och har inget behov av ytterligare färgning. För att erhålla bilder med större detalj, valde vi konfokalmikroskopi som möjliggör rekonstruktion av tredimensionella strukturer från de erhållna bilderna. Tredimensionell rekonstruktion ger förmågan att differentiera mellan hyfer växer runt i stället för i eller genom en makrofag. Konidier kan också vara exakt särskiljas som intracellulär kontra extracellulärt.
Med användning av denna metod för ex vivo-analys av den antifungala aktiviteten hos makrofager tillsammans med in vivo-fungal utmaning, som tidigare visade vi att NADPH-oxidas i makrofager spelar en viktig roll i försvaret mot A. fumigatus 4. Användningen av isolerade alveolära makrofager gör att vi kan fokusera på sin svampdödande aktivitet i frånvaro av andra immunceller (t.ex. rekryterade neutrofiler) som försvarar mot Aspergillus in vivo.
<p class…The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av det nationella institutet för allergi och infektionssjukdomar Grant R01AI079253 (till BHS), och av National Cancer Institute Cancer Center Support Grant CA016056 till Roswell Park Cancer Institute.
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit for General Cell Membrane Labeling | Sigma | PKH26GL-1KT | |
2,2,2 Tribromoethanol | Sigma | T48402 | Used to make AvertinAnesthetic |
2-methyl-2-butanol | Sigma | A-1685 | Used to make AvertinAnesthetic |
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (without calcium and magnesium) | Corning | 21-031-CV | |
NH4CL | Sigma | A0171 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
KHCO3 | Sigma | P91444 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
EDTA | Sigma | E6758 | Used to make ACK red cell lysis buffer |
22 gauge X 1.00 inch i.v. catheter | BD | 381523 | Insyte Autoguard Winged |
insulin syringes | |||
6 ml syringes | |||
4-way stopcock | Fisher Scientific | 50-700-077 | |
suture thread | |||
50 ml conical centrifuge tubes | |||
gauze sponges (4 inch square) | |||
RPMI 1640 with L-glutamine | Corning | 10-040-CV | |
Fetal Bovine Serum | Hyclone | SH30396.03 | heat inactivated |
Hema 3 Stain Set | Fisher Scientific | 22-122-911 | |
Cytoseal 60 | Thermo Scientific | 8310-4 | |
Sabouraud Brain Heart Infusion Agar with Chloramphenicol and Gentamicin Slants | BD | 297252 | |
Aspergillus fumigatous strain expressing green fluorescent protein | provided by Dr Margo Moore, Simon Fraser University, Burnaby, BC, Canada | ||
100 micron Cell Strainers | BD Falcon | 64753-00 | |
scissors | |||
forceps | |||
Biological Safety Cabinet Class II | |||
Sorval ST40 Centrifuge with swing bucket rotor | |||
Leica DM1000 light microscope | |||
Hemocytometer | |||
Cytospin 2 centrifuge | Thermo Scientific | ||
Cell Culture Incubator | 37 °C, 5% CO2 | ||
22X22 mm micro cover glass | VWR | 48366-227 | glass coverslips |
6 well Cell Culture Plates | Corning | 3506 | |
10% Neutral Buffered Formalin | VWR | BDH0502-1LP | |
Vectashield Mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
Leica TCS SP2 system with a laser point scanner | Mounted on DMIRE2 fluorescence microscope |