Фундаментальный Технический Элементы замерзания перелома / Зафиксированные-травления в биологическом электронной микроскопии
Summary
Основные методы и уточнения обработки замораживания-разрушения биологических образцов и наноматериалов для обследования с помощью просвечивающей электронной микроскопии описаны. Эта техника является предпочтительным методом для выявления ультраструктурные особенности и специализации биологических мембран и для получения мерных и пространственные данные ультраструктурным уровня в материаловедении и нанотехнологической продукции.
Abstract
Замерзание перелом / заморозить травления описывает процесс, при котором образцы, как правило, биологические или наноматериал в природе, заморожены, перелом, и воспроизведены в генерировать углерода / платина "бросить", предназначенный для исследования методом просвечивающей электронной микроскопии. Образцы подвергают сверхбыстрой ставок замораживания, часто в присутствии криопротекторов, чтобы ограничить образование кристаллов льда, с последующим разрыва образца при охлаждаемым жидким азотом температуру в высоком вакууме. Полученный перелом поверхность тиражируется и стабилизируется испарения углерода и платины под углом, что придает поверхности трехмерной детали к броску. Эта техника оказалась особенно поучительно для исследования клеточных мембран и их специализаций и внес значительный вклад в понимание клеточных форме к соответствующей функции клеток. В этом докладе, мы рассматриваем требования инструмента и технический протокол для выполнениясублимационной перелом, связанный номенклатура и характеристики самолетов разрушения, вариации на обычной процедуры и критерии интерпретации замораживанием перелом изображений. Эта техника широко используется для ультраструктурным расследования во многих областях клеточной биологии и перспективен как новой техники визуализации для молекулярной, нанотехнологии, и материаловедение исследования.
Introduction
Понятие и практическое применение обработки замораживания-разрушения биологических образцов было введено Стир 1 более полувека назад. Ранняя аппарат присвоил разрозненные компоненты в рабочую автономного блока 1. Оригинальный аппарат был изменен и перерабатывается в коммерчески доступных инструментов для того, чтобы учесть крайнюю необходимость удаленного манипулирования, поддержания высокого вакуума, и испарение углерода и металлов для производства реплику подходящий для обследования с помощью просвечивающей электронной микроскопии (рисунок 1 и рисунок 2).
Типичный прибор состоит из высокой вакуумной камере с образцом таблицы и микротома руку, имеющей регулируемые жидкие пропускную азота (рисунок 1). Камера также находятся два электронных пушек, один для стабилизации углерода испарения расположенный на 90 ° углом к сцене образца, а другой для Platiкол / углерода слежки в регулируемым углом, обычно 15 ° – 45 ° (рисунок 2). Питание ресивера применяется для работы вакуумного насоса и электронные панели регулировать регулировки температуры и электронный контроль над огнестрельным оружием.
Первоначально задуманный как средство для достижения улучшенной визуализации вирусов, заморозить-перелом, полученный еще большую популярность в качестве метода для проверки и анализа клеточных мембран и их специализаций 2, 3. В самом деле, эта процедура является неотъемлемой частью выяснения структуры / функции отношения в клетках и тканях, и многие из этих исследований стоят как классических вкладов в клеточной и молекулярной биологии 4-9. Основная цель и обоснование для развития техники сублимационной перелома в том, чтобы ограничить артефакты, наблюдаемые в электронно-микроскопического разрешения, вытекающие из химической фиксации и обработки, используемой в обычных биологических электронной микроскопии. Здесь цель состоит в том, чтобы ограничить химическуюфиксация и заморозить образца с достаточной скоростью и часто в присутствии криопротекторов в того, чтобы ограничить образование кристаллов льда и других замораживание артефакты. Совсем недавно, эта техника нашла всплеск интереса от молекулярных биологов и материаловедения следователей для изучения наночастиц и наноматериалов.
Мораторий-перелом и заморозить травления изображения демонстрируют трехмерный характер и иногда ошибочно принимают за сканирующем электронном микроскопе. Тем не менее, замораживанием перелом препараты рассматриваются с помощью просвечивающей электронной микроскопии и их большой вклад в морфологических исследований с высоким разрешением является их уникальный представление структуры / функциональных элементов клеточных мембран. Замораживание-перелом обработки инициируется замораживание клеток и тканей с достаточной скоростью, чтобы ограничить кристаллизации льда и / или с использованием криопротекторов агентов, таких как глицерин. Затем образцы перелом в вакууме и репутациейLICA порождается испарения углерода и платины над поверхности излома. Оригинальный экземпляр переваривается из реплики, которые извлекается на стандартную EM образца сетки. Еще одна распространенная неправильная интерпретация замораживанием перелом изображений является то, что они изображают поверхности клеток. Однако основная предпосылка сублимационной перелома в том, что биологические мембраны разделены через липидный бислой в процессе разрушения (рисунок 3). Этот процесс в биологических мембранах дает два лица разрушения, один, который показывает организацию половины мембраны, прилегающей к цитоплазме, ПФ-лица, и один, который показывает половину бимолекулярного листовки мембраны, которая примыкает к внеклеточной среда, EF-лицо. Истинные клеточные поверхности, не представлены в замораживанием перелом изображений, но появляются только тогда, когда последующий добавил шаг сублимационной травления в соответствии с процедурой разрушения используется. Для того, чтобы эффективно травления ранее перелом образцы по выявлению поверхностные Detaiл, образцы должны быть заморожены с большой скоростью и без unetchablecryoprotectant. Травление воды с поверхности образца трещиноватых, раскрывающих, лежащие в основе функции достигается путем установки охлаждения микротомных руку над стадии образца, создавая разность температур между стадии, удерживающий образец и охлаждающей микротомных рычаг, который заставляет воду, чтобы сублимировать с поверхности. Когда вода сублимируется с поверхности образца разрушенных во время замораживания-травления маневра, то аспекты реальных поверхностей клеток, внеклеточный матрикс, цитоскелета структур и молекулярных агрегатов могут быть выявлены с высоким разрешением. Таким образом сублимационной перелом и заморозить травления не взаимозаменяемые термины, а скорее отражают поэтапный процесс последний из которых не может быть необходимым или желательным в зависимости от нужд конкретного исследования.
После ледостава перелома / стоп-травления процедуры, сломанные поверхности подвергаются направленных evaporaного слоя углерода и платины в целях обеспечения поддержки и изображений контраст с репликой. / Углерода испарения изображений платина может быть однонаправленным или поворотные и осуществляется либо сопротивление или электронных пушек. Однонаправленный затенение от известным углом, обычно 30º – 45 °, полезно при выполнении отдельных расчеты морфометрических. Образцы, которые были подвергнуты глубокой травления обычно поворотные тени и полученные образы этих образцов фотографически вспять для оценки.
Историческая, а также присутствует цель сублимационной перелома / заморозить травления техники является ограничение химическую фиксацию и обработку образца артефактов, которые связаны с более традиционными передачи процедур электронной микроскопии. Тем не менее, этот метод обеспечивает существенную преимущество в его способности придавать трехмерную деталь и тем самым облегчить приобретение морфометрических данных в биологических, материаловедения, и нanotechnology образцы. Мораторий-перелом и заморозить травления процедуры сложны и многогранны и некоторые аспекты его применения настроены. Эта презентация открывается вид обследования из главных особенностей процесса и отсылаем читателя к комплексным опубликованных протоколов 10, 11 в целях решения детали и настроить процесс для конкретных потребностей в области исследований.
Protocol
Representative Results
Discussion
В годы после его введения и коммерческой доступности, сублимационной перелом / травления процедуры были широко использованы для исследования биологической структуры мембраны. В самом деле, лучшие перспективы некоторых структурных специализации мембран были получены в вымораживание…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| sodium dichromate | various suppliers | ||
| sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Freon | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of the outer dynein arm. J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J. The ciliary membrane. CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
