العناصر الفنية الأساسية من تجميد كسر / تجميد حفر في البيولوجية المجهر الإلكتروني
Summary
ويرد التقنيات الأساسية والتحسينات معالجة تجميد كسر العينات والمواد النانوية البيولوجية للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. هذا الأسلوب هو الأسلوب المفضل للكشف عن الملامح التركيبية والتخصصات الأغشية البيولوجية وللحصول على البيانات والأبعاد المكانية مستوى التركيبية في علوم المواد وتكنولوجيا النانو المنتجات.
Abstract
يصف تجميد كسر / تجميد عملية يتم بموجبها حفر العينات والبيولوجية عادة أو المواد متناهية الصغر في الطبيعة، والمجمدة، ومتشظية، وتكراره لتوليد الكربون / البلاتين "الزهر" يهدف للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ. تخضع العينات معدلات تجميد ultrarapid، وغالبا في وجود وكلاء واق من البرد للحد من تكوين بلورات الجليد، مع انقسام لاحق من العينة في النيتروجين السائل تبريد تحت درجات حرارة عالية فراغ. يتم نسخ سطح بكسر الناتجة واستقرت عن طريق التبخر من الكربون والبلاتين من زاوية أن يمنح السطح التفاصيل ثلاثي الأبعاد لالمدلى بها. وقد أثبتت هذه التقنية المنير خاصة للتحقيق في أغشية الخلايا وتخصصاتهم، وساهمت إلى حد كبير في فهم النموذج الخلوي للخلية وظيفة ذات الصلة. في هذا التقرير، إلا أننا مسح متطلبات الصك والبروتوكول الفني لأداءتجميد الكسر، والتسمية وخصائص الطائرات كسر المرتبطة بها، الاختلافات على الإجراء التقليدي، ومعايير لتفسير الصور للتجمد الكسر. وقد استخدمت هذه التقنية على نطاق واسع لتحقيق التركيبية في العديد من مجالات بيولوجيا الخلية ويبشر بالخير باعتبارها تقنية التصوير الناشئة عن الجزيئي، وتكنولوجيا النانو، ودراسات علوم المواد.
Introduction
تم تقديم مفهوم والتطبيق العملي لمعالجة تجميد كسر العينات البيولوجية بواسطة Steere 1 قبل أكثر من نصف قرن. جهاز أوائل خصصت المكونات المتباينة إلى مكتفية ذاتيا وحدة العمل 1. تم تعديل الجهاز الأصلي وصقلها في الأدوات المتاحة تجاريا من أجل استيعاب الحاجة الماسة للتلاعب عن بعد، وصيانة فراغ عالية، وتبخر الكربون والمعادن لإنتاج نسخة طبق الأصل مناسبة للفحص بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ (الشكل 1 والشكل 2).
يتكون الصك النموذجي لفراغ الغرفة عالية مع جدول العينة وجود الذراع مشراح ريغولابلي الانتاجية النيتروجين السائل (الشكل 1). يضم غرفة أيضا على مسدسين الإلكترون، واحدة لتحقيق الاستقرار تبخر الكربون المتمركزة على 90º زاوية لمرحلة عينة والآخر لالبلاتين عيوالأسطوانات / الكربون التظليل في زاوية قابلة للتعديل، وعادة 15º – 45º (الشكل 2). يتم تطبيق السلطة الى وحدة لتشغيل مضخة فراغ والألواح الإلكترونية ينظم تعديل درجة الحرارة والإلكترون السيطرة على السلاح.
تصور أصلا كوسيلة لتحقيق تحسين التصوير من الفيروسات وتجميد كسر اكتسبت المزيد من الشعبية كأسلوب لفحص وتحليل أغشية الخلايا وتخصصاتهم 2، 3. في الواقع، كان هذا الإجراء جزءا لا يتجزأ من توضيح العلاقات هيكل / وظيفة في الخلايا والأنسجة والعديد من هذه الدراسات الوقوف صفا ومساهمات الكلاسيكية إلى الخلية والبيولوجيا الجزيئية 4-9. كان الهدف الرئيسي والأساس المنطقي لتطوير تقنية تجميد كسر للحد من التحف ملاحظتها في الإلكترون المجهري المستمدة من قرار التثبيت الكيميائية والمعالجة التقليدية المستخدمة في المجهر الإلكتروني البيولوجي. هنا الهدف هو الحد الكيميائيةتثبيت وتجميد العينة مع سرعة كافية وغالبا في وجود cryoprotectant من أجل الحد من تكوين بلورات الجليد والتحف تجميد الأخرى. وفي الآونة الأخيرة، وقد وجدت هذه التقنية تجدد الاهتمام من علماء البيولوجيا الجزيئية والمحققين علوم المواد للفحص الجسيمات النانوية والمواد النانوية.
تجميد كسر وتجميد حفر الصور تظهر طابع ثلاثي الأبعاد، وأحيانا مخطئون لالميكروسكوب الإلكتروني الماسح. ومع ذلك، يتم فحص الاستعدادات للتجمد الكسر بواسطة المجهر الإلكتروني النافذ ومساهمة رئيسية لدراسات مورفولوجية عالية الدقة هو تمثيلها فريد من عناصر هيكل / وظيفة أغشية الخلايا. يبدأ التجهيز تجميد كسر من خلال تجميد الخلايا والأنسجة مع سرعة كافية للحد من بلورة الجليد و / أو مع استخدام وكلاء cryoprotectant مثل الجلسرين. ثم يتم كسر العينات تحت فراغ ومندوبيتم إنشاء LICA عن طريق التبخر من الكربون والبلاتين على سطح كسر. يتم هضم العينة الأصلية من النسخ المتماثلة التي يتم استردادها على معيار EM العينة الشبكة. سوء تفسير آخر شائع من الصور للتجمد الكسر هي أنها توضح سطوح الخلايا. لكن المنطلق الأساسي لتجميد كسر هو أن يتم تقسيم الأغشية البيولوجية من خلال طبقة ثنائية الدهون من خلال عملية كسر (الشكل 3). هذه العملية في الأغشية البيولوجية غلة جهان كسر، واحد الذي يكشف عن تنظيم نصف الغشاء الملاصق للالسيتوبلازم، وPF وجه، واحد الذي يكشف عن نصف النشرة ثنائي الجزيء من الغشاء الذي هو المتاخمة للخارج الخلية الوسط، وEF وجه. لا تمثل سطوح الخلايا الحقيقية في الصور تجميد كسر ولكن تظهر فقط عند استخدام الخطوة اللاحقة أضاف تجميد الحفر باتباع الإجراء الكسر. من أجل حفر العينات بشكل فعال بكسر سابقا للكشف عن سطح التفصيللتر، يجب أن يتم تجميد العينات بمعدل سريع وبدون unetchablecryoprotectant. ويتم إنجاز الحفر من المياه من سطح العينة بكسر كشف الميزات الأساسية عن طريق وضع ذراع مشراح التبريد خلال المرحلة عينة خلق فرق درجة الحرارة بين مرحلة عقد العينة والتبريد الذراع مشراح الذي يسبب الماء لسامية من على سطح الأرض. عندما يتم تصعيد المياه من سطح العينة بكسر خلال المناورة-الحفر تجميد، ثم قد كشفت جوانب الأسطح الفعلية الخلية المصفوفة خارج الخلية، والهياكل هيكل الخلية، والتجمعات الجزيئية في ارتفاع القرار. وبالتالي تجميد كسر وتجميد حفر ليست حيث تبادل بل تعكس عملية تدريجية وهذه الأخيرة التي قد لا يكون ضروريا أو مرغوبا فيه تبعا لاحتياجات الدراسة معينة.
بعد تجميد كسر / حفر إجراءات تجميد، تتعرض السطوح المتصدعة إلى evapora موجهةTIVE المعاطف من الكربون والبلاتين من أجل تقديم الدعم والتصوير النقيض من النسخة المتماثلة. قد يكون البلاتين / الكربون أحادي الاتجاه أو التبخر التصوير الدوارة ويتم إنجاز إما المقاومة أو البنادق الإلكترون. التظليل أحادي الاتجاه من زاوية معروفة، وعادة 30º – 45º، مفيد في أداء العمليات الحسابية المورفولوجية معينة. العينات التي تعرضوا إلى أعماق الحفر وعادة ما تكون دوارة مظلل ويتم عكس الصور الناتجة من هذه العينات فوتوغرافيا للتقييم.
التاريخية فضلا عن الهدف الحالي للتجميد كسر / تجميد حفر تقنية هو الحد التثبيت الكيميائية ومعالجة العينات القطع الأثرية التي ترتبط مع المزيد من إجراءات انتقال المجهر الإلكتروني التقليدية. ومع ذلك، توفر هذه التقنية ميزة جوهرية في قدرته على إضفاء التفاصيل ثلاثي الأبعاد، وبالتالي تسهيل الحصول على البيانات المظهرية في البيولوجي، وعلم المواد، ونالعينات anotechnology. إجراءات تجميد كسر وتجميد حفر معقدة ومتعددة الأوجه، ويتم تخصيص بعض جوانب تطبيقها. يقدم هذا العرض وجهة نظر الدراسة من السمات الرئيسية لعملية ويشار القارئ لبروتوكولات شاملة نشرت 10 و 11 من أجل معالجة التفاصيل وتخصيص عملية لتلبية احتياجات بحثية محددة.
Protocol
Representative Results
Discussion
في السنوات التالية مقدمته والتوافر التجاري، تجميد كسر / واستخدمت على نطاق واسع لحفر إجراءات التحقيق في هيكل غشاء البيولوجي. في الواقع، لقد تم الحصول على أفضل وجهات النظر من بعض التخصصات الهيكلية للأغشية في الاستعدادات تجميد كسر / حفر. وساهمت هذه الدراسات ليس فقط لفهم…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This presentation was supported by a Clinical Innovator Award to JLC from the Flight Attendant Medical Research Institute and by the United States Environmental Protection Agency. Although the research described in this article has been funded wholly or in part by the United States Environmental Protection Agency through Cooperative Agreement CR83346301 with the Center for Environmental Medicine, Asthma, and Lung Biology at The University of North Carolina at Chapel Hill, it has not been subjected to the Agency’s required peer and policy review, and therefore does not necessarily reflect the views of the Agency and no official endorsement should be inferred. Mention of trade names or commercial products does not constitute endorsement or recommendation for use.
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| Balzers Freeze-fracture/freeze-etch plant | Balzers | BAF400T | |
| Standard buffers | various suppliers | ||
| standard aldehyde fixatives | various suppliers | ||
| sodium dichromate | various suppliers | ||
| sulfuric acid | various suppliers | ||
| Disposable supplies for Platinum/Carbon Evaporation | Technotrade International | ||
| Liquid nitrogen | various suppliers | ||
| Freon | various suppliers | ||
| Disposable supplies for electron microscopy | Electron Microscopy Sciences | ||
| Transmission electron microscope | Carl Zeiss Inc. |
References
- Steere, R. L. Electron microscopy of structural detail in frozen biological specimens. J Biophysic and BiochemCytol. 3, 45-60 (1957).
- Pinto da Silva, P., Branton, D. Membrane splitting in freeze-etching. Covalently bound ferritin as a membrane marker. J Cell Biol. 45, 598-605 (1970).
- Friend, D. S., Gilula, N. B. Variations in tight and gap junctions in mammalian tissues. J Cell Biol. 53, 758-776 (1972).
- Branton, D. Fracture faces of frozen membranes. ProcNatlAcadSci USA. 55, 1048-1056 (1966).
- Heuser, J. E., Reese, T. S., Dennis, M. J., Jan, Y., Jan, L., Evans, L. Synaptic vesicleexocytosiscaptured by quick freezing and correlated with quantal transmitter release. J Cell Biol. 81, 275-300 (1979).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of inner dynein arms, radial spokes, and the central pair/projection complex of cilia and flagella. J Cell Biol. 100, 2008-2018 (1985).
- Goodenough, U. W., Heuser, J. E. Substructure of the outer dynein arm. J Cell Biol. 95, 798-815 (1982).
- Hirokawa, N., Heuser, J. E. Quick-freeze, deep-etch visualization of the cytoskeleton beneath surface differentiations of intestinal epithelial cells. J Cell Biol. 91, 399-409 (1981).
- Hirokawa, N. Quick freeze, deep etch of the cytoskeleton. Methods Enzymol. 134, 598-612 (1986).
- Chandler, D. E., Sharp, W. P., Kuo, J. o. h. n. Freeze fracture and freeze etching. Electron Microscopy: Methods and Protocols. Methods in Molecular Biology. 1117, 95-132 (2014).
- Severs, N. J. Freeze-fracture electron microscopy. Nature Protocols. 2, 547-576 (2007).
- Gilula, N. B., Satir, P. The ciliary necklace. A ciliary membrane specialization. J Cell Biol. 53, 494-509 (1972).
- Rohatgi, R., Snell, W. J. The ciliary membrane. CurrOpin Cell Biol. 22, 541-546 (2010).
- Fisch, C. F., Dupuis-Williams, P. Ultrastructure of cilia and flagella-back to the future. Biol Cell. 103, 249-270 (2011).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C., Rose, J. G. Morphometric aspects of ciliary distribution and ciliogenesis in human nasal epithelium. Proc Nat Acad Sci. 78, 6996-6999 (1981).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Smith, C. A. New observations on the ultrastructure of mammalian conducting airway epithelium: Application of liquid propane freezing and rotary shadowing techniques to freeze-fracture. J Ultrastr Res. 89, 23-33 (1984).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Leigh, M. W., Hu, S. S., Boat, T. F. Development organization, and function of tight junctional complexes in the tracheal epithelium of infant ferrets. Am Rev Respir Dis. 138, 666-674 (1988).
- Coyne, C. B., Gambling, T. M., Boucher, R. C., Carson, J. L., Johnson, L. G. Role of claudin interactions in airway tight junctional permeability. Am J Physiol. 285, 1166-1178 (2003).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural studies of hamster tracheal epithelium in vivo and in vitro. J Ultrastr Res. 70, 70-81 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructural characterization of epithelial cell membranes in normal human conducting airway epithelium: A freeze-fracture study. Am J Anat. 173, 257-268 (1985).
- Charles, A. C., Naus, C. C. G., Zhu, D., Kidder, G. M., Dirksen, E. R., Sanderson, M. J. Intercellular calcium signaling via gap junctions in glioma cells. J Cell Biol. 118, 195-201 (1992).
- Sanderson, M. J., Charles, A. C., Dirksen, E. R. Mechanical stimulation and intercellular communication increases intercellular CA2+ in epithelial cells. Cell Regul. 1, 585-596 (1990).
- Welsch, F., Stedman, D., Carson, J. L. Effects of a teratogen on [3H]uridine nucleotide transfer between human embryonal cells and on gap junctions. Exp Cell Res. 159, 91-102 (1985).
- Carson, J. L., Willumsen, N. J., Gambling, T. M., Hu, S. S., Collier, A. M. Dynamics of intercellular communication and differentiation in a rapidly developing mammalian airway epithelium. Am J Respir Cell & Molec Biol. 1, 385-390 (1989).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Clyde, W. A. Ciliary membrane alterations occurring in experimental Mycoplasma pneumoniae infection. Science. 206, 349-351 (1979).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. Ultrastructural observations on cellular and subcellular aspects of experimental Mycoplasma pneumoniae disease. Infect & Immun. 29, 1117-1124 (1980).
- Henshaw, N. G., Carson, J. L., Collier, A. M. Ultrastructural observations of Pneumocystis carinii attachment to rat lung. J Infect Dis. 151, 181-186 (1985).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Hu, S. S. The appearance of compound cilia in the nasal mucosa of normal human subjects in response to acute, low level sulfur dioxide exposure. Environ Res. 42, 155-165 (1987).
- Carson, J. L., Collier, A. M., Gambling, T. M., Knowles, M. R., Boucher, R. C. Ultrastructure of airway epithelial cell membranes among patients with cystic fibrosis. Hum Pathol. 21, 640-647 (1990).
- Carson, J. L., Brighton, L. E., Collier, A. M., Bromberg, P. A. Correlative ultrastructural investigations of airway epithelium following experimental exposure to defined air pollutants and lifestyle exposure to tobacco smoke. InhalToxicol. 25, 134-140 (2013).
- Boonstra, J., et al. Immunocytochemical demonstrations of cytoplasmic and cell-surface EGF receptors in A431 cells using cryo-ultramicrotomy, surface replication, freeze-etching and label fracture. J Microscopy. 140, 119-129 (1985).
- Fujimoto, K. Freeze-fracture replica electron microscopy combined with SDS digestion for cytochemical labeling of integral membrane proteins. Application to the immunogold labeling of intercellular junctional complexes. J. Cell Sci. 108, 3443-3449 (1995).
- Quinn, P. J. The effect of tocopherol on the structure and permeability of phosphatidylcholine liposomes. J Control Release. 160, 158-163 (2012).
