Raccolta ed estrazione di Saliva DNA per il sequenziamento di nuova generazione
Summary
DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.
Abstract
The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.
Introduction
Ottenere DNA di alta qualità per gli studi genetici umani è essenziale nel processo di scoperta del gene della malattia. Sangue, anche se richiede una procedura invasiva e anche di essere più costoso di raccolta della saliva, è favorito per la creazione di linee cellulari immortalizzate come una fonte infinita di DNA, o iPSCs per studi funzionali, e, talvolta, il DNA del sangue viene utilizzato quando le linee cellulari non sono disponibili. Tuttavia, il prelievo di sangue richiede un flebotomo addestrato e il sangue ha una emivita più breve di saliva 1. DNA dalla saliva è meno costoso e più facile da ottenere, dal momento che può essere raccolto e inviato attraverso la posta elettronica, senza la necessità di un flebotomo, aumentando così i potenziali soggetti piscine ben oltre il bacino di utenza di ospedali e laboratori 2. Studio iscrizione può essere migliorata quando i soggetti hanno la possibilità di dare un campione di saliva al posto del sangue 3, 4. Preoccupazioni circa la quantità e la qualità del DNA dalla saliva possono aver limitato la sua diffusione di noie nonostante i numerosi studi recenti studi che mostrano l'idoneità di tutta la saliva, con una media di 4,3 x 10 5 cellule per millilitro, per il test del DNA rispetto ai più tamponi buccali metodi che non abbiano conseguito notevoli quantità di saliva 2, 3, 4, 5, 6. Mentre una modesta letteratura esistente che mostra l'idoneità di tutta la saliva DNA derivato per le applicazioni di genotipizzazione compresi i metodi basati su microarray 8, 9, 10, nessuno studio ha esaminato sequenziamento di nuova generazione (NGS). L'obiettivo di ottimizzare l'intero protocollo di estrazione del DNA della saliva è stato quello di massimizzare la quantità e la qualità per le applicazioni della genetica in un modo economicamente efficace che può essere facilmente implementato in laboratorio con reagenti e materiali di consumo comuni.
Estrazione del DNA dalla saliva richiede diverse procedure: 1) raccolta e conservazione, 2) la lisi cellulare, 3) trattamento RNasi, 4) la precipitazione delle proteine, 5) precipitazione in etanolo, 6) reidratazione del DNA. La soluzione di DNA Stabilizzazione tampone, descrittoin precedenza 2, funzioni adeguatamente senza alterazione. Nessun tentativo di ottimizzare il trattamento RNasi e DNA fasi di reidratazione è stata fatta. Per ogni passo rimanente, diverse variabili che potrebbero influenzare il rendimento sono stati identificati. Ogni variabile è stato manipolato individualmente e miglioramento della resa e la qualità è stata valutata statisticamente. Per le variabili che sono stati mostrati per migliorare il rendimento e / o la qualità del DNA, i valori ottimali sono stati inclusi nel protocollo finale.
Protocol
Representative Results
Discussion
La presente procedura è un protocollo di estrazione del DNA ottimizzato che ha notevolmente migliorato la resa del DNA ad alto peso molecolare rispetto ai metodi standard, senza compromettere la qualità del DNA. La fase critica con l'effetto più grande sulla resa più era punto 5.2, che comprende una fase di centrifugazione più a lungo durante precipitazione in etanolo di qualsiasi protocollo pubblicato recensito qui, tranne uno che non è stato ampiamente distribuito 11. Non sono stati rilevati cambi…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was funded by a National Institutes of Health R01 (DC009453 support to CWB).
Materials
| 15ml Centrifuge Tubes | Fisher | 12-565-268 |
| Cell Lysis Solution | Qiagen | 158908 |
| Proteinase K | Sigma | P6556 |
| Protein Precipitation Solution | Qiagen | 158912 |
| Isopropanol | Fisher | A416-4 |
| Glycogen | EZ-BioResearch | S1003 |
| 70% Ethanol | Fisher | 04-355-305 |
| Tris-EDTA (TE) | Fisher | BP2473-1 |
| NaCl | Fisher | AC194090010 |
| Tris HCl | Fisher | BP1757-100 |
| EDTA(0.5M) Solution | Fisher | 03-500-506 |
| Sodium Dodecyl Sulfate | Fisher | BP166-100 |
| Equipment | ||
| Name of Equipment | Distributor | Catalog# |
| Analog Vortex Mixer | Fisher | 02-215-365 |
| Centrifuge 5810R | Eppendorf | 5811 000.010 |
References
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