This video protocol demonstrates a method to study effects of seminal fluid in gastropods, using the hermaphroditic freshwater snail Lymnaea stagnalis.
I internt gödsling djur, är sädesvätska brukar läggas till spermier, tillsammans bildar sperma eller ejakulat. Förutom närande och aktivering av spermier, kan komponenterna i sädesvätskan också påverka kvinnliga fysiologin att öka befruktning framgång spermadonator. Även om många studier har rapporterat sådana effekter i arter med olika könen, har få studier behandlas detta i samtidigt hermafroditiska djur. Denna video-protokollet presenteras en metod för att studera effekterna av sädesvätska i snäckor, med användning av en samtidigt hermafroditiska sötvattenssnäcka, den stora dammsnäcka Lymnaea stagn, som modellorganism. Medan förfarandet visas med hjälp av kompletta prostatakörteln extrakt, kan enskilda komponenterna (dvs proteiner, peptider och andra föreningar) i sädesvätskan testas på samma sätt. Effekter av mottagandet av ejakulerar komponenter på äggläggning kan kvantifieras i termer av frekvens för äggläggning ochmer subtila bedömningar av kvinnliga reproduktionsförmåga, såsom ägg nummer inom varje ägg massorna. Resultaten visar att sädesvätska proteiner påverkar kvinnliga reproduktionskapaciteten i denna samtidiga hermafrodit, belysa deras betydelse för sexuell selektion.
Vid överlåtelse är spermier brukar åtföljas av sädesvätska produceras av manliga tillbehör körtlar. Medan vissa ejakulat komponenter spelar roller i närande och aktivering av spermier 1, andra påverkar kvinnlig fysiologi i syfte att öka fertilisering framgång spermoljedosering 2-4. Sådana effekter är särskilt utvalda för att, via sexuell selektion, när en art är mycket promiskuösa och har effektiv spermier lagring och sperma matsmältning. Under sådana förhållanden, spermadonatorer tävlar tungt för befruktning av ägg 5. Samtidigt som det finns rikligt Correlational belägg för betydelsen av sädesvätskan ämnen för manlig befruktning framgång, är direkta bevis mer sällsynta och få studier har grävde i detaljerna i fysiologiska förändringar och / eller substanser som ingår 6.
I arter med skilda kön (dvs män och kvinnor, gonochorists) finns det några väl undersökt modell species när det kommer till sädesvätska sammansättning och deras effekter. Exempel på detta är fruktflugan, Drosophila melanogaster 6, malariamyggan, Anophelesgambiae 7, och den röda mjölbagge, Tribolium castaneum 8. Sådana sädesvätska studier är mycket ovanligare när det gäller arter som samtidigt är hermafroditer (dvs individer är funktionellt manligt och kvinnligt på samma gång), även om denna typ av reproduktion är vanligt i hela djurriket 9. Den mest anmärkningsvärda hermafroditiska exempel på överföring av ett tillbehör körtel ämne är förmodligen inspelningen av så kallade kärleks dart i mark sniglar 2,10, där ämnet överförts av den spermadonator via subkutan injektion 11,12, dvs inte tillsammans med spermier. Men det finns många samtidiga hermafroditer som överför manliga tillbehör körtel produkter tillsammans med deras sperma,såsom modellarter som används här, den stora dammen snigel Lymnaea stagn. Tidigare forskning har redan visat att mottagandet av sädesvätska påverkar kvinnliga reproduktiva produktionen av denna art 13-15, och flera av de inblandade sädesvätska proteiner har identifierats 16,17.
Det övergripande målet för detta protokoll, som är en förlängning av de metoder som redovisas i Koene et al 16, är att testa effekterna av sädesvätska proteiner på olika parametrar för äggläggning i snäckor. Detta åstadkoms genom dissektion av prostatakörteln (dvs den manliga tillbehör körtel som producerar sädesvätskan) av sexuellt isolerade givar sniglar från en standardiserad laboratoriekultur. För det andra är donatorns sperma som samlats in från sädesblåsorna och olika behandlingslösningar görs. Därefter prov sniglar bedövades och intravaginalt injiceras med en testlösning (t.ex.prostatakörtelextrakt ensam, prostatakörtelextrakt med spermier, enbart spermier, enbart bärarmedium). Dessa test sniglar sedan kontrolleras för följande dagar till veckor, under normala förhållanden, för att spela in äggläggning. Egg massor samlas, digitalt skannas för att räkna och mäta olika parametrar, och sedan lägga i enskilda flaskor för kläckning. Efter ungefär två veckor är ungarna räknas och digitalt skannas. Alla skanningar, av både ägg massor och ungar, analyseras sedan med hjälp av en fritt tillgänglig bildanalys programpaket.
För detta protokoll laboratorium stam av stora dammsnäcka, Lymnaea stagn, används, som är uppfödd vid VU University i Amsterdam. Arten fungerar som ett modellsystem för att utreda frågor om sexuellt urval och reproduktion i hermafroditer. Djurets relativt stora storlek gör det experimentellt mycket tillgänglig. Dessutom, eftersom det används som modell i många biological discipliner som vi redan vet en hel del om den grundläggande biologin av dessa djur. Denna metod kommer att hjälpa till att studera frågor om processer av sexuell selektion som förmedlas via sädesvätska proteiner i allmänhet. Dessutom, eftersom dessa är samtidiga hermafroditer, är det möjligt att ta itu med om sådana proteiner agerar i liknande och / eller olika sätt som de gör i arter där könen separeras 16,17.
Den presenterade protokoll visar hur man samlar sädesvätska och hur man testar detta i ett biologiskt meningsfullt sätt. Även om detta förfarande här visas med användning av prostatakörtelextrakt, kan effekten av en enda renad sädesvätska protein också testas genom att följa samma procedur. Självklart, det är i sådana tester alltid viktigt att ta med ordentliga kontroller (sken behandlingar) för att se till att förfarandet och / eller datamediet inte påverkar parametrarna i frågorna 14,16. Med hjälp av denna metod, har det redan visat sig att det finns en enda sädesvätska protein, nämligen Ovipostatin, som förmedlar en minskad äggläggning 14,16. Detta protein, som produceras i prostatakörteln och överförs under parning tillsammans med spermier, representerar den första helt karakteriserade sädesvätska komponent i en samtidig hermafrodit och gör, så långt, inte visar någon likhet med kända proteiner.
Upptäckten att Ovipostatenn minskar ägg massproduktion i mottagaren bekräftar tidigare arbete som visar att ämnen i sädesvätskan kan påverka äggläggning 13-15. Genom att överföra biologiskt relevanta beloppen (se 3.2 16), kan man på ett övertygande sätt visa att det är en sädesvätska protein, och inte förekomsten av spermier själva, som förmedlar den observerade minskningen av äggläggningen (Figur 1). Med tanke på att upprepad mottagandet av sädesvätska via naturliga parningar ökar investeringen per ägg 15, nu blir det högst relevant att kvantifiera andra parametrar för äggläggning. Den presenterade protokollet ger nu de nödvändiga metoder för att göra detta. Även om ingen effekt hittades i Ovipostatin på kläckning framgång för de ägg som av mottagaren 16, kan det finnas andra sädesvätska proteiner som samverkar om med detta protein. Därför parametrar som behöver kvantifieras i detta sammanhang – bredvid om frekvens och ägg nummer – inkluderar ägg storlek, hatching tid, nykläckt utveckling och hatchling storlek. Dessutom är det möjligt att titta på effekterna på andra kvinnliga processer än äggläggning, såsom sperma lagring och användning, samt fördelning av reproduktiva resurser mot den kvinnliga och manliga funktion 14,17. Det är uppenbart att den presenterade metoden avgörande itu med dessa uppföljande frågor, både i Lymnaea stagn och i andra sötvattensniglar.
Sammanfattningsvis experiment med detta protokoll visar att överförda sädesvätska proteiner påverkar den kvinnliga reproduktionsförmågan hos mottagaren i dessa samtidiga hermafroditer. Med tanke på att få studier har tagit upp detta, är det sannolikt att bli mycket vanligare i internt gödsling hermafroditer än idag återspeglas i den vetenskapliga litteraturen. Speciellt när man inser att pre-copulatory partnerval och konkurrens spermier har visat sig spela en viktig roll i dessa hermafroditer 14, vilket highlights potentialen i dessa manliga tillbehör körtel proteiner som sexuellt väljas i detta system. Slutligen bidrar denna forskning till stöd för utveckling av uppfattningen att sädesvätska proteiner är lika viktiga för samtidiga hermafroditer som de är för separata-könsbestämmas arter.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar MR Helmus för voice-over, CM Popelier, S. Ypenburg och C. Levesque för tekniskt stöd. Denna forskning stöds ekonomiskt av den nederländska organisationen för vetenskaplig forskning (NWO), Royal Netherlands Academy of Arts and Sciences (KNAW) och Japan Student Services Organization (Jasso). Denna publikation har stöd av en Open Access-bidrag på NWO till JMK.
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
fish food flakes | TetraPhyll | ||
stereo microscope | |||
small surgical scissors | WPI | ||
coarse and fine forceps | WPI | ||
10 ml syringe | |||
injection needles (0.3mmx13mm) | |||
50 Mm MgCl2 | |||
5.83 mmol L-1 CaCl2•2H2O | |||
3.76 mmol L-1 MgCl2•6H2O | |||
42.69 mmol L-1 NaCl | |||
37.53 mmol L-1 KCl | |||
Two component Silicon | Sylgard | ||
1 mm syringes | |||
Silicon tubing (diameter 1 mm) | |||
blunted injection needles (0.3mmx13mm) | |||
Tubes | Eppendorff | ||
460-ml perforated containers | |||
metal leaf puncher (19.6 cm2) | |||
spatula/spoon | |||
(laptop) computer | |||
flatbed scanner | |||
millimeter scale | |||
transferring plates | |||
glass tiles | |||
20 ml glass vials |