En protokoll for å infisere<em> Caenorhabditis elegans</em> Med<em> Salmonella typhimurium</em
Summary
C. elegans har dukket opp som en ny genetisk modell for å studere vert-patogen interaksjoner. Her beskriver vi en protokoll for å infisere C. elegans med Salmonella typhimurium kombinert med dobbel tråd RNAi forstyrrelser teknikk for å undersøke hvilken rolle verts gener i forsvar mot Salmonella-infeksjon.
Abstract
I det siste tiåret, C. elegans har dukket opp som en invertebrate organisme for å studere interaksjoner mellom vertene og patogener, inkludert vertsforsvar mot gram-negative bakterien Salmonella typhimurium. Salmonella etablerer vedvarende infeksjon i tarmen hos C. elegans og resulterer i tidlig død av infiserte dyr. Et antall mekanismer for immunitet har blitt identifisert i C. elegans å forsvare seg mot Salmonella infeksjoner. Autophagy, en evolusjonært konservert lysosomal degradering veien, har vist seg å begrense Salmonella replikasjon i C. elegans og i pattedyr. Her er en protokoll som er beskrevet for å infisere C. elegans med Salmonella typhimurium, hvori ormer er utsatt for Salmonella i en begrenset tid, i likhet med Salmonella-infeksjon hos mennesker. Salmonella-infeksjon i betydelig grad forkorter levetiden for C. elegans </ Em>. Ved hjelp av den essensielle autophagy genet BEC-en som et eksempel, kombinert vi denne infeksjonen metoden med C. elegans RNAi fôring tilnærming og viste denne protokollen kan brukes til å undersøke funksjonen av C. elegans verts gener i forsvar mot Salmonella-infeksjon. Siden C. elegans hele genomet RNAi biblioteker er tilgjengelige, gjør det mulig denne protokollen til omfattende screene for C. elegans gener som beskytter mot Salmonella og andre mage-tarm patogener hjelp genome-wide RNAi biblioteker.
Introduction
Den frittlevende jord nematode Caenorhabditis elegans er en enkel og genetisk medgjørlig modell organisme brukes til å studere mange biologiske spørsmål. C. elegans dominant eksisterer som selvstendig gjødsling hermafroditter. Hannene blir spontant generert av ikke-disjunksjon av X-kromosomet under gametogenesis 1,2. I nærvær av tallrike mat, C. elegans kontinuerlig utvikle seg gjennom fire larvestadier til voksen. Temperaturen påvirker også C. elegans utvikling; raskere utvikling observeres ved høyere temperaturer. I laboratoriet C. elegans dyrkes ved en vanlig temperatur på 20 ° C på agarplater med seeded bakterien Escherichia coli (stamme OP50) som mat 1,2.
I det siste tiåret, C. elegans har dukket opp som en virvelløse organisme å studere vert-patogen interaksjoner 3-5. I naturen C. elegans spiser bakterier som sin nutrient kilde 1,2. Sin normale bakterie laboratorium mat, OP50, kan lett erstattes med andre patogener for å undersøke samspillet mellom C. elegans og en valgt patogen. Under disse forholdene, er tarmen det primære stedet for infeksjonen. Faktisk har et bredt spekter av bakterielle patogener er vist å lethally infisere C. elegans 3-5.
Den gram-negative bakterien Salmonella er en gastrointestinal patogen som forårsaker menneskelig matbåren sykdom på verdensbasis 6,7. C. elegans er en god modell vert for Salmonella typhimurium som denne bakterien gjentak og viser vedvarende tarminfeksjoner 8-10. C. elegans har blitt brukt til å identifisere både nye og tidligere kjente Salmonella virulensfaktorer 11.. Interessant, C. elegans immunsystem vellykket begrenser Salmonella replikering. Det har tidligere blitt rapportert at inhiberingition av autophagy gener gjengir økt Salmonella replikering i C. elegans, som resulterer i tidlig død av infiserte ormer 10. Macroautophagy (heretter kalt autofagi) er en dynamisk prosess som involverer omorganisering av subcellulære membraner til å beslaglegge cytoplasma og organeller for levering til lysosome for degradering 12. Autophagy har blitt rapportert til å begrense Salmonella replikasjon i C. elegans og i pattedyr 10,13.
The C. elegans genom var den første flercellede eukaryote genom sekvensert; det er lydhør overfor RNAi behandling 14-16. Videre kan RNAi administreres effektivt ved å utsette ormer å innta bakterier inneholdende dobbelt-trådet RNA i target-genet, kjent som RNAi foring 16,17. Hele genomet RNAi fôring bibliotekene har blitt generert for genome-wide RNAi screening 16,18. Heri, en salmonellainfeksjon proprotokollen er kombinert med RNAi fôring å tillate testing C. elegans gener av interesse for deres evne til å beskytte mot Salmonella-infeksjon.
Protocol
Representative Results
Discussion
C. elegans er en enkel genetisk modellorganisme som spiser bakterier som sin næringskilde. Dermed er det lett å erstatte den normale bakterielle mat med en intestinal patogen for å undersøke interaksjonen mellom C. elegans og det valgte patogen. Heri en protokoll er beskrevet å kombinere Salmonella infeksjon og C. elegans RNAi fôring behandling for å undersøke hvilken rolle verts gener i forsvar mot Salmonella-infeksjon. Tidligere infeksjon protokoller utsett C. e…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Dr. Diane Baronas-Lowell for kritisk lesing av manuskriptet. Dette arbeidet ble støttet av en FAU Charles E. Schmidt College of Science Seed Grant og en aldrende stipend fra Ellison Medical Foundation til KJ
Materials
| LB Broth | Fisher | BP9723-500 | |
| XLD agar | EMD Chemicals | 1.05287.0500 | |
| Bacto Agar | Fisher | DF0140-01-0 | |
| Peptone | Fisher | BP1420-500 | |
| Sodium Chloride | Fisher | S671-500 | |
| Calcium Chloride | Fisher | C69-500 | |
| Magnesium Sulfate | Fisher | M65-500 | |
| IPTG | Gold Biotechnology | 12481C50 | |
| Cholesterol | Sigma | C8667-25G | |
| Ampicillin | Fisher | BP1760-25 | |
| Salmonella typhimurium | ATCC | ATCC14028 | |
| Petri Dish 95 x 15mm | Fisher | FB0875714G | |
| Petri Dish 60 x 15mm | Fisher | 08-757-13A | |
| Falcon Serological pipet | Fisher | 13-668-2 | |
| Falcon Express Pipet-Aid | Fisher | 13-675-42 | |
| MaxQ6000 shaking incubator | Thermo Scientific | SHKE6000-7 | |
| Incubator | Percival | I-36DL |
References
- Riddle, D. L., Blumenthal, T., Meyer, B. J., Priess, J. R. . C. elegans II. , (1997).
- Brenner, S. The Genetics of Caenorhabditis elegans. Génétique. 77, 71-94 (1974).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Caenorhabditis elegans as a host for the study of host-pathogen interactions. Curr Opin Microbiol. 5, 97-101 (2002).
- Kurz, C. L., Ewbank, J. J. Caenorhabditis elegans: an emerging genetic model for the study of innate immunity. Nat Rev Genet. 4, 380-390 (2003).
- Mylonakis, E., Aballay, A. Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions. Infection and Immunity. 73, 3833-3841 (2005).
- Ford, M. W., et al. A descriptive study of human Salmonella serotype typhimurium infections reported in Ontario from 1990 to 1997. Can J Infect Dis. 14, 267-273 (2003).
- Voetsch, A. C., et al. FoodNet estimate of the burden of illness caused by nontyphoidal Salmonella infections in the United States. Clin Infect Dis. 38 Suppl 3, (2004).
- Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. M. Salmonella typhimurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans. Curr Biol. 10, 1539-1542 (2000).
- Alegado, R. A., Tan, M. W. Resistance to antimicrobial peptides contributes to persistence of Salmonella typhimurium in the C. elegans intestine. Cell Microbiol. 10, 1259-1273 (2008).
- Jia, K., et al. Autophagy genes protect against Salmonella typhimurium infection and mediate insulin signaling-regulated pathogen resistance. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106, 14564-14569 (2009).
- Tenor, J. L., McCormick, B. A., Ausubel, F. M., Aballay, A. Caenorhabditis elegans-based screen identifies Salmonella virulence factors required for conserved host-pathogen interactions. Curr Biol. 14, 1018-1024 (2004).
- Levine, B., Klionsky, D. J. Development by self-digestion: molecular mechanisms and biological functions of autophagy. Developmental Cell. 6, 463-477 (2004).
- Birmingham, C. L., Smith, A. C., Bakowski, M. A., Yoshimori, T., Brumell, J. H. Autophagy controls Salmonella infection in response to damage to the Salmonella-containing vacuole. J Biol Chem. 281, 11374-11383 (2006).
- . The C. elegans Sequencing Consortium. Genome sequence of the nematode C. elegans: a platform for investigating biology. Science. 282, 2012-2018 (1998).
- Fire, A., et al. Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Nature. 391, 806-811 (1998).
- Kamath, R. S., Martinez-Campos, M., Zipperlen, P., Fraser, A. G., Ahringer, J. Effectiveness of specific RNA-mediated interference through ingested double-stranded RNA in Caenorhabditis elegans. Genome Biol. 2, 1-10 (2001).
- Liang, J., Xiong, S., Savage-Dunn, C. Using RNA-mediated interference feeding strategy to screen for genes involved in body size regulation in the nematode C elegans. J. Vis. Exp. (72), (2013).
- Fraser, A. G., et al. Functional genomic analysis of C. elegans chromosome I by systematic RNA interference. Nature. 408, 325-330 (2000).
- Stiernagle, T. Maintenance of C. elegans. WormBook: the online review of C elegans biology. , 1-11 (2006).
- Aballay, A., Ausubel, F. M. Programmed cell death mediated by ced-3 and ced-4 protects Caenorhabditis elegans from Salmonella typhimurium-mediated killing. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 98, 2735-2739 (2001).
- Melendez, A., et al. Autophagy genes are essential for dauer development and lifespan extension in C. elegans. Science. 301, 1387-1391 (2003).
