The zebrafish is a powerful model system for developmental biology and human disease research due to their genetic similarity with higher vertebrates. This protocol describes a methodology to create haploid zebrafish embryos that can be utilized for forward screen strategies to identify recessive mutations in genes essential for early embryogenesis.
Den zebrafisk har blivit en mainstream ryggradsdjur modell som är relevant för många discipliner av vetenskaplig studie. Zebrafisk är särskilt väl lämpade för fram genetisk analys av utvecklingsprocesser på grund av sin yttre befruktning, embryonal storlek, snabba ontogeni och optisk klarhet – en konstellation av egenskaper som gör det möjligt att direkt observation av händelserna från gastrulation till organogenesen med ett grundläggande stereomikroskop. Vidare kan zebrafiskembryon överleva i flera dagar i den haploida tillstånd. Produktionen av haploida embryon in vitro är ett kraftfullt verktyg för mutationsanalys, eftersom den gör det möjligt att identifiera recessiva muterade alleler närvarande i första generationen (F1) kvinnliga bärare efter mutagenes i föräldra (P) generation. Detta tillvägagångssätt eliminerar nödvändigheten att höja flera generationer (F2, F3, etc.) som innefattar odling av mutant familjer, vilket sparar forskaren tid tillsammans med att minskabehoven av zebrafisk koloni utrymme, arbetskraft, och djurhållningskostnader. Även om zebrafisk har använts för att genomföra fram skärmar för de senaste decennierna har det skett en stadig ökning av transgena och genomredigeringsverktyg. Dessa verktyg erbjuder nu en uppsjö av sätt att skapa nyanserade analyser för nästa generations skärmar som kan användas för att ytterligare dissekera genreglerande nätverk som driver ryggradsdjur ontogenin. Här beskriver vi hur man förbereder haploida zebrafisk embryon. Detta protokoll kan implementeras för nya framtida haploida skärmar, t.ex. i förstärkare och suppressor skärmar, för att ta itu med de mekanismer för utvecklingen för ett brett antal processer och vävnader som bildas under tidiga embryonala stadier.
De fundamentala processer som orkestrera ryggradsdjur utveckling är i stort sett bevarad 1. Ett kraftfullt sätt att identifiera gener med viktiga roller i utvecklingen är att isolera ärftliga mutationer som leder till fenotypiska brister i processen för intresset. Den zebrafisk, Danio rerio, är en liten sötvattens teleost arter som tillhör Cyprinidae fisk familj som har blivit en allmänt använd modell organism för ryggradsdjur utvecklingsgenetik under de senaste decennierna 2. Zebrafisk ägg befruktas externt, ger tillträde till zygoten från uppkomsten av befruktning 3. Vidare är det tidiga embryot optiskt transparent, vilket möjliggör visualisering av utveckling med ett enkelt stereomikroskop 3. Zebrafisk ontogeny är snabb, med processerna för klyvning, gastrulation och organogenesen av många strukturer, såsom hjärtat och njurarna, i stort sett genomförda under den första dagen av utveckling 3. Than tid från larvstadier till sexuell mognad tar 2-3 månader, och de vuxna är små ryggradsdjur ca 3-4 cm i längd, kan så många fiskar upprätthållas i minimalt utrymme 2. Dessutom, zebrafisk vuxna har hög fruktsamhet, med varje fisk kan producera flera hundra embryon per vecka 2. Dessa attribut har gjort att spårbarhet av zebrafisk för framåt och bakåt genetiska skärmar. Zebrafisk har en hög grad av bevarande i deras anatomi, cellbiologi och fysiologi med mer avancerade ryggradsdjur som däggdjur 2,4. I själva verket har nyligen sekvensanalys visade att zebrafisk genomet innehåller homologer till nästan 70% av mänskliga gener 5. Detta bevarande har möjlig forskare att använda zebrafisk som modell för många mänskliga sjukdomar, inklusive både embryonala och vuxna förhållanden 2,4. Sammantaget har dessa faktorer gjort zebrafisk ett utmärkt system för skärmar syftar till att identifiera gener som ärviktiga för normal ryggradsdjur ontogeni.
Ett antal storskaliga skärmar har genomförts i zebrafisk och har identifierat flera tusen mutationer i utvecklingsgener 6-8. Den zebrafisk vuxen man är mottaglig för mutagenes, och kromosomförändringar kan genereras med relativt hög frekvens med hjälp av kemisk mutagen etylnitrosourea (ENU) 6,7 eller retroviral insertionsmutationer 9. Hittills har över 9000 ärftliga mutationer skapats, och inkluderar gener som påverkar så gott som alla aspekter av embryogenes. Den zebrafisk samfundet har upprättat en central bank av dessa mutanter på Zebrafish International Resource Center (eller Zirc) 10, som har samlat cirka 5.000 muterade och transgena alleler från hela världen. Många av dessa mutationer har analyserats och klonats, vilket ger forskare över biologiska discipliner värdefull information som har använts för att retas isär numerous cellulära och fysiologiska vägar genom de insikter ursprung med zebrafisk experiment.
Även termins skärmar har identifierat ett imponerande antal viktiga gener, har mycket ännu att uppskattas om de genetiska regulatoriska nätverk som förmedlar en myriad av processer. Många skärmar som genomförts hittills har inte nått mättnad, och därmed framåt samt omvända genetiska skärmar har varit en hörnsten för att identifiera och analysera mekanismer för embryogenes. Även om det finns enorma insikter som kan utläsa från någon enskild zebrafisk mutant linje, har en viktig begränsande faktor inom området historiskt varit tidskrävande insats som krävs i positionell kloning. Därför har identiteten på många kemiskt inducerade mutationer förblev ett mysterium. Men med den senaste tillkomsten av hela genom sekvensering metoder som underlättar snabb kloning 11-14, är nu fe oerhört effektiv identifiering av genetiska mutationerasible.
Den prototypiska fram skärmen i zebrafisk är en diploid skärm som kan identifiera recessiva mutationer inom tre generationer 6,7 (fig 1, vänstra kolumnen). Denna teknik innebär att generera mutationer i mänskliga könsceller föräldra (P) hane, och sedan para denna hane med en vild typ hona. Var och en av den första generationen (F1) avkomma från denna parning kommer att härbärgera en eller flera unika mutationer på grund av de kromosomala bidragen av den muterade paternal genomet. F1 avkomman höjs och utparade med vilda typer för att skapa F2 familjer. I F2-familjen, kommer syskon antingen vildtyp eller heterozygota bärare, och är incrossed slumpmässigt generera F3 kopplingar som analyseras för fenotyp (er) av intresse. De F3 kopplingar av heterozygota bärare kommer att innehålla 25% vild typ, 50% heterozygot, och 25% homozygot mutant fiskar. Denna flera generationer screening schema är effektivt, men en stor nackdel med detta enILLVÄGAGÅNGSSÄTT omfattar den tid som krävs för att förbereda sig för skärmen: minst 1 år av enbart fiskhållningen är inblandad, eftersom varje generation kräver ca 3 månader för att bli könsmogna. Andra begränsningar av denna typ av diploida skärmen är arbetet, utrymme och kostnader för bostäder dessa generationer.
Den haploida skärmen är ett alternativ som kan användas för att identifiera och därefter isolera recessiva mutationer med användning av liknande mutagenesstrategierna 15 (fig 1, högra kolumnen). Produktionen av haploida zebrafiskembryon beskrevs först över 30 år sedan 16, och förmågan hos den normalt diploid zebrafisk utvecklas under flera dagar med en haploid kromosom ploiditet har utnyttjats för ett flertal genetiska studier, eftersom denna tid. Den största fördelen med den haploida skärmen är att metoden inte innebär att lyfta F2 familjer för att screena för recessiva muterade alleler. Istället är F1-generationen honor utvärderas förheterozygositet av recessiva mutationer i processen för intresse genom att granska deras F2 avkomma i en haploid tillstånd (Figur 1, höger kolumn). Sammantaget stegen för att upphandla haploida embryon är relativt enkelt (Figur 2). Efter beredning av nödvändiga lösningar för hantering spermier, är ägg från F1-generationens hondjur av manuell manipulation för att pressa (eller "squeeze") äggen från magen. När äggen erhålles, är de befruktade in vitro genom exponering för ultraviolett (UV)-inaktiv spermier. UV-inaktiverat spermie är oförmögna att bidra livsduglig DNA till ägg beroende på det faktum att den korta våglängd UV-tvärbinder paternal DNA. Men spermierna fortfarande kan utlösa ägg aktivitet och händelser i samband med zygotisk utveckling. När metabolisk aktivering, kommer ägget slutföra meios II, och fortsätta att utvecklas med endast den matern deponerade kopia av varje chromosomig. På grund av detta 1 N ploidi, är embryot omfattas av utvecklings konsekvenserna av en recessiv mutant allel, om den finns på en maternal kromosom. Varje F2 haploid koppling kommer alltså att innehålla 50% vildtyp och 50% muterade embryon om modern är en heterozygot bärare av ett helt penetrant recessiv allel. Denna fördelning av embryonala genotyper möjliggör relativt lätt när det gäller att utvärdera kopplingen för närvaron av mutantfenotypen (er) av intresse. Om en sådan fenotyp upptäcks F1-generationen kvinnliga grundare senare utparade till vildtyp manliga zebrafisk för att skapa och höja fler heterozygota bärare. Eftersom det inte är nödvändigt att ta upp flera generationer för att utföra på skärmen, kan forskaren spara mycket tid, arbete och akvarium utrymme, men fortfarande har makt att överblicka ett stort antal av genom baserat på antalet F1-hondjur undersökas. Således haploida skärmar är speciellt möjligt för små laboratorier eller projekt som initieras i absence av betydande finansiering.
Emellertid finns det flera begränsningar och nackdelar med användningen av haploider. Först haploida zebrafisk embryon lever endast några dagar, och oftast dör mellan 3 och 5 dagar efter befruktningen (DPF) 15. Haploid zebrafisk embryon kan skiljas från diploider baserade på flera egenskaper, främst bland dem är en kort och tjock kropp som ändå har det normala antalet somit segment 15,17. Som utvecklingen fortskrider, hjärnan uppvisar ökad celldöd och cirkulationen är dålig, vanligen i samband med blod sammanslagning med 2-3 dpf och ödem 15,17. Vidare haploider misslyckas med att blåsa upp en simblåsa 15,17. Oavsett dessa morfologiska skillnader, är de flesta stora organ och vävnader bildas, inklusive hjärta, öga, och notochord 15,17. Ett inslag noteras om haploida kopplingar är att de innehåller en rad olika fenotyper vad gäller sorter av defekta embryon & #8212; en funktion observeras över zebrafiskstammar. Därför bör man kontrollera om vävnaden (s) och tids sevärdhet visar någorlunda normal utveckling i det vilda typen haploida stammen och har därför potential att utvärderas för genetiska defekter i en skärm eller annan forskningsprojekt.
Trots dessa utmaningar har haploida skärmar genomförts framgångsrikt för att identifiera gener som behövs för tidiga utvecklingsprocesser i zebrafisk, och haploida protokoll har väl etablerade resurser i samhället i många år 15-19 år. På senare tid har processen att skapa haploida fiskembryon använts av forskare för att skapa haploid embryonala stamceller (ES) cellkulturer från medaka fisk 20,21. Efter framställning av medaka haploida embryon in vitro, var embryona för att härleda primära cellkulturer som passerades under ca 15 veckor, följt av ytterligare 5-8 veckor för att generera rena kloner av haploida celler medES-cellegenskaper 15-19 år. Den generation av fisk haploida ES cellinjer har bred framtidslöfte för analys av recessiva fenotyper i ryggradsdjur cellinjer, och representerar en ny metod för genetisk analys under de kommande åren. Sålunda har alstringen av haploida fiskembryon växande tillämpningar inom det biomedicinska forskningssamhället. Denna video artikeln ger en visuell demonstration av stegen med att producera haploida zebrafisk embryon in vitro med hjälp av UV-inaktiv sperma utifrån fastställda protokoll 15-19,22.
Haploid screening är en användbar teknik för att upptäcka viktiga gener nödvändiga för tidiga utvecklingsstadier. Vidare, odling av haploida celler från medaka fisken har använts för att isolera ES-liknande cellinjer som har ett stort antal forskningsansökningar och potential, visar att haploida celler kan ge en värdefull framtida mötesplats för andra typer av ryggradsdjur genetiska studier 20,21. Detta protokoll ger en demonstration av de som arbetar med att utföra produktionen av haploida zebrafisk embryon genom befruktning in vitro med UV-inaktiv sperma metoder. Denna metod kan användas för att utföra framåt haploida skärmar med muta F1 fisk, vilket kan göras med hjälp av vild typ, transgena eller muterade stammar för förstärkare / suppressor screening.
Trots screening tiden med en haploid strategi är vida förkortas jämfört med diploida screening, kommer det ändå att ta flera månader att slutföra. Som vi descrisäng tidigare, det finns många fördelar som finns genom att utföra en skärm med hjälp av en haploid schema, som alla kan hjälpa till att göra nya bidrag till den aktuella kunskapen om valfritt antal utvecklingsmässiga händelser. Den haploida skärm metod är mer effektiv för identifiering av recessiva muterade alleler än diploida-baserade skärmar på grund av minskningen av tid, rum och antalet fiskar som behövs. Men det finns flera fallgropar att en haploid skärm. En haploid skärm kan bara identifiera mutanter i gener som är aktiva inom de första dagarna av utveckling, eftersom embryot bara kan överleva under en begränsad tid med en haploidgenom. Gener som uttrycks senare i utvecklingen skulle behöva identifieras med en annan metod, t.ex. en diploid skärm. Dessutom har vissa organ inte utvecklas ordentligt i en haploid organism. Det kan finnas anatomiska avvikelser, eller en fördröjd tid för utveckling, som kan orsaka mutationen missas av den haploida screeningteknik. Jagn Dessutom har vissa stammar av fisk inte utvecklas lika bra i en haploid tillstånd 15. Haploider kan kategoriseras av en betygs rad goda, intermediära och lång embryonala funktioner, med A-embryon är den mest normala, B att utse embryon med defekter i axeln men ett klart huvud och svans, och C / D för att utse embryon med oigenkännliga egenskaper (massorna av celler ovanpå äggula bollar) 15,17. Proportionerna av embryon inom dessa kategorier varierar från zebrafisk stam, med ökat antal bättre kvalitet haploider vanligare i synnerhet genetisk bakgrund 15,17. Tack vare dessa faktorer, är det nödvändigt att finna en lämplig stam av zebrafisk att utföra mutagenes och efterföljande korsningar. I vår senaste erfarenhet, producerade den vilda typen Tübingen stammen livskraftiga haploider för screening (som visas i figur 3 och 4) men historiskt zebrafisk forskare har utnyttjat AB eller AB * stammarna för haploid experimsentation 15.
Förutom dessa ovan nämnda utmaningar kommer inte alla grundmålade vuxen zebrafisk honor producera en koppling på att utföra klämtekniken. Till exempel i arbetet med ENU-muterade Tübingen stam honor, ungefär hälften av alla kvinnor producerade en koppling på klämma, och någon bråkdel av dessa (vanligen 10-30%) var dålig embryo kvalitet eller kunde inte gödslas. Således, för att utföra en haploid skärm man måste planera för att ta upp minst dubbelt så många fiskar som behövs för att screena det önskade antalet av genom (varje hona representerar en genomet screenas). Oberoende av detta övervägande, fördelarna med haploida metod för screening för att täcka ett stort antal genomet utan en massiv djuranläggning är faktiskt ganska betydande om analysen är mottaglig för den haploida tillstånd. Dock bör det också påpekas att ytterligare studier av mutationen (er) som anges i den haploida kopplingen är helt beroende av ett framgångsrikt höja enn utparning från den kvinnliga grundare. Som med alla skärmar, "hits" från början identifierades under urvalsförfarandet måste åter identifieras i diploida tillstånd.
Trots de fallgropar med att använda den haploida skärmen, har det visat sig vara mycket framgångsrik i att identifiera mutanter, som har analyserats på djupet med insiktsfulla vinster till det vetenskapliga området 15. Haploid skärmar kan genomföras för att undersöka andra dåligt kända processer av ryggradsdjur utveckling. Använda haploider för förstärkare och suppressor-skärmar är ett sätt att få mer insikt i verksamheten och reglerande nätverk av en gen av intresse. Den haploida screeningsteknik kan också användas för att identifiera förstärkare och suppressorer av mutanter som redan har isolerats genom metoder såsom kemisk eller insertionsmutationer eller omvänd genetik ansatser som markberedning, eller TALENS. I korthet kan den tidigare isolerade mutanten mutageniseras med ENU och screenas för förstärkare eller suppressors i den ursprungliga mutanta fenotypen. Mutanten måste kunna nå vuxenstadier, så det är nödvändigt att ha en heterozygot djur eller en svag homozygot mutant fisk för att utföra denna skärm, men nya framsteg inom transgenes har tillåtit forskare att kjol detta problem. Att lära sig att manipulera vägar i utvecklingen kan leda till många spännande möjligheter, inklusive möjligheten av störande vägar för behandling av sjukdomstillstånd.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av finansiering till RAW från följande: NIH bidrag K01 DK083512, DP2 OD008470, och R01 DK100237; March of Dimes Basil O'Connor Startat Scholar Award # 5-FY12-75; starta upp medel från University of Notre Dame College of Science och Institutionen för Biological Sciences; och en generös gåva till University of Notre Dame från Elizabeth och Michael Gallagher på uppdrag av Gallagher Family främja stamcellsforskning. Finansiärerna hade ingen roll i studiedesign, datainsamling och analys, beslut att publicera, eller beredning av manuskriptet. Vi tackar de stavar av Institutionen för Biological Sciences för deras stöd, och Centrum för Zebrafish forskning på Notre Dame för deras enastående engagemang i vård och omsorg om våra zebrafisk koloni. Vi tackar GF Gerlach för att ta fotografier som i Figur 4. Slutligen vill vi tacka alla medlemmar i vår forskningslabb för sina kommentarer, diskussioner och obetydhts om detta arbete.
Name of Reagent/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Hank's Stock Solution #1 | 8.0 g NaCl, 0.4 g KCl in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #2 | 0.358 g Na2HPO4 anhydrous; 0.60 g K2H2PO4 in 100 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #4 | 0.72 g CaCl2 in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Stock Solution #5 | 1.23 g MgSO4-7H2O in 50 ml ddH2O | ||
Hank's Premix | Combine in the following order: (1) 10.0 ml HS#1, (2) 1.0 ml HS#2, (3) 1.0 ml HS#4, (4) 86 ml ddH2O, (5) 1.0 ml HS#5. Store all HS Solutions and Premix at 4 degrees Celcius. | ||
Hank's Stock Solution #6 | 0.35 g NaHCO3 in 10.0 mls ddH2O; make fresh on day of use. | ||
Hank's Final working solution | Combine 9.9 ml of Hank's Premix with 0.1 ml HS Stock #6 | ||
XX-Series UV Bench lamp | UVP | 95-0042-05 | Model XX-15S Bench Lamp |
XX Bench Stand (Adjustable) | UVP | 18-0062-01 | Model XX-15 Stand |
Embryo incubation dish | Falcon | 35-1005 | |
50 X E3 | 250 mM NaCl, 8.5 mM KCL, 16.5 mM CaCl2, 16.5 mM MgSO4 in distilled water. Supplement with methylene blue (1 x 10-5 M) (Sigma M9140) to inhibit contamination. | ||
1 X E3 | Dilute 50 X E3 in distilled water | ||
Stereomicroscope | Nikon | SMZ645; SMZ1000 |