Cette présentation démontre une méthode dans laquelle l’électroporation de cellules adhérentes et cultivées est utilisée pour l’étude de la communication intercellulaire et jonctionnelle, tandis que les cellules se développent sur une lame recouverte d’oxyde d’indium-étain conducteur et transparent.
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Article de méthode
Une analyse fonctionnelle pour les jonctions lacunaires examen; Électroporation des cellules adhérentes sur Indium Tin Oxide-
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans cette technique, les cellules sont cultivées sur une lame de verre partiellement recouverte d’oxyde d’indium-étain (ITO), un matériau transparent et conducteur d’électricité. Une variété de molécules, telles que des peptides ou des oligonucléotides, peuvent être introduites dans 100 % des cellules de manière non traumatique. Ici, nous décrivons comment il peut être utilisé pour étudier la communication intercellulaire et jonctionnelle lacunaire. Le jaune de Lucifer pénètre dans les cellules lorsqu’une impulsion électrique, appliquée sur la surface conductrice sur laquelle elles se développent, provoque la formation de pores à travers la membrane cellulaire. C’est l’électroporation. Les cellules qui se développent sur la surface du verre non conducteur immédiatement adjacente à la région électroporée n’absorbent pas le jaune de Lucifer par électroporation, mais acquièrent le colorant fluorescent lorsqu’il leur est transmis via des jonctions lacunaires qui les relient aux cellules électroporées. Les résultats du transfert du colorant d’une cellule à l’autre peuvent être observés au microscope sous éclairage de fluorescence. Cette technique permet une quantification précise de la communication jonctionnelle des lacunes. De plus, il peut être utilisé pour l’introduction de peptides ou d’autres molécules non perméables, et le transfert de petits peptides électroporés via des jonctions lacunaires pour inhiber le signal dans les cellules adjacentes non électroporées est une démonstration puissante de l’inhibition du signal.
Introduction
L'application d'un courant électrique à une cellule provoque la formation de pores de la membrane de la cellule, par un processus appelé électroporation. Les pores permettent le passage d'une variété de molécules à travers la membrane nonpermeant. Le champ électrique peut être commandée avec précision, de sorte que les pores formés sont très petites et se referment rapidement, avec un minimum de perturbation de la physiologie cellulaire. Fait intéressant, les cellules adhérentes sont cultivées sur une lamelle de verre revêtue d'oxyde d'indium-étain conductrice et transparente (ITO) et une électroporation in situ, qui se trouve sur la surf....
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Protocole
1 Placage des cellules dans la électroporation Chambers
- Dans une hotte à flux laminaire, trypsiniser les cellules en utilisant une technique stérile, comme d'habitude.
NOTE: Il est très important d'éliminer par centrifugation toutes les traces de la trypsine, car ils peuvent entraver la propagation des cellules sur la vitre, d'où la formation d'adhérentes et les jonctions communicantes. - Introduire à la pipette 1 ml de la suspension de cellules dans des chambres d'électroporation stérile fourni avec l'électroporation in situ (Figure 1), et les placer dans un 37 o C, incubateur à C....
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Résultats
La figure 2 montre foie de rat cellules épithéliales de T51B électroporation avec 22, LY et photographiées sous fluorescence (panneau A et B) ou à contraste de phase (C), ci-après la fixation d'éclairage et de lavage. Dans le panneau A, le bord de la zone électroporation est marqué en rouge. Le gradient de fluorescence à la droite de la ligne rouge indique transfert à travers les jonctions communicantes. Dans la figure 3A et 3B, la quantification de la co.......
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Discussion
Les étapes critiques dans le protocole
Matériau électroporation
La pureté de la matière à une électroporation est très important. Si les cellules sont très plates, des concentrations plus élevées alors du colorant de suivi doivent être utilisés (jusqu'à 20 mg / ml pour LY) et dans de tels cas, la pureté est encore plus important que dans les cellules avec une forme plus sphérique 1. Outre LY une grande variété d'autres colorants ou des molécules nonpe.......
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Déclarations de divulgation
L’auteur correspondant est l’inventeur d’un brevet détenu par l’Université Queen’s, qui a été concédé sous licence à Cell Projects Inc. L’entreprise ou l’université n’avait aucune influence sur le contenu du journal.
Remerciements
Nous remercions Lowell Cochran pour l’aide experte en vidéographie. Nous remercions LR pour l’aide financière des Instituts de recherche en santé du Canada (IRSC), de la Fondation canadienne du cancer du sein (FCCS, section de l’Ontario), du Conseil de recherches en sciences naturelles et en génie du Canada (CRSNG), de l’Alliance canadienne pour la recherche sur le cancer du sein, des Centres d’excellence de l’Ontario, de Breast Cancer Action Kingston et du Fonds de legs Clare Nelson sous forme de subventions à LR. SG a été récipiendaire d’une bourse de recherche du CRSNG. MG a été soutenue par une bourse postdoctorale du US Army Breast Cancer Program, du ministère....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| DMEM | Cellgro http://www.cellgro.com/ | 50-013-PB | |
| DMEM sans Hyclone de Calcium | (Thermo scientific : http://www.thermoscientific.com) | SH30319-01 | |
| Sérum de veau donneur ; | PAA : http://www.paa.com/ | Cat.# B15-008 | |
| Sérum de veau fœtal | PAA : http://www.paa.com/ | Cat.# A15-751 | |
| Appareil d’électroporation | Cell Projects Ltd Royaume-Uni : http://www.cellprojects.com/ | ACE-100 | |
| Chambers | Cell Projects Ltd Royaume-Uni | ACE-04-CC | 4 puits |
| Chambers | Cell Projects Ltd Royaume-Uni | ACE-08-CC | 8 puits |
| Lucifer Yellow | Cell Projects Ltd Royaume-Uni | ACE-25-LY | Haute pureté |
| CelTak | BD Biosciences | 354240 | Adhésif cellulaire et tissulaire |
| Fibronectine | Sigma Aldrich | F1141 | |
| Collagène | BD Biosciences | 354236 | |
| Poly-Lysine | Sigma Aldrich | P8920 |
Références
- Raptis, L., et al. Electroporation of Adherent Cells in Situ for the Study of Signal Transduction and Gap Junctional Communication. Electroporation protocols. , The Humana Press Inc. edited by S Li 167-183 (2008).
- Giorgetti-Peraldi, S., Ottinger, E., Wolf, G., Ye, B., Burke, T. R., Shoelson, S. E. Cellu....
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Réimpressions et autorisations
