重组纤维素酶Cel5A从表达<em>里氏木霉</em>在烟草
Summary
烟草植物被用于生产真菌纤维素酶，TrCel5A，通过一个瞬时表达系统。的表达可以用荧光融合蛋白进行监测，并且该蛋白质的活性进行了表征后表达。
Abstract
纤维素降解酶，纤维素酶，是研究和产业利益的目标。这些酶在难以培养微生物，如菌丝建设真菌和厌氧菌的优势，加快了在这一领域的使用重组技术。植物表达的方法是理想的系统，用于大规模生产的酶和其它工业上有用的蛋白质。本文中，对于真菌内切葡聚糖酶， 里氏木霉 Cel5A，在烟草中的瞬时表达方法被证实。成功的蛋白表达被示出，使用的mCherry-酶融合蛋白的荧光监测。此外，一组基本的测试是用来检查瞬时表达T的活动里氏木霉 Cel5A，包括SDS-PAGE，Western印迹，酶谱，以及荧光和基于染料的基质降解试验。这里所描述的系统可以被用来产生活性细胞ulase在很短的时间周期，从而通过组成型或诱导型表达系统，以评估植物中用于进一步的生产潜力。
Introduction
木质纤维素生物质，其转化为液体燃料的退化已经被设想为一个方法，以减少对化石燃料依赖。在建立经济上可行的生物处理系统中的一个显著障碍是在纤维素和半纤维素1的酶促降解。植物表达系统显示为酶在工业规模上生产的巨大潜力。农业系统收获植物经济和体积都已经建立起来，因为他们已经数千年之久。纤维素酶在植物中的生产是可取的，由于像易于自动水解2，以及用于最大限度地通过增加植物细胞壁1消化率使用较低的酶水平的潜在因素。最后，厂房系统允许重组蛋白的靶向植物细胞的特定区域，并能翻译后修饰酶在有需要时3。
ve_content“>烟草 （烟草）是很常用的植物模式生物的外源蛋白表达的研究，由于其快速增长和生物量的积累功能4。重组蛋白的瞬时表达是一种技术，它允许在短的时间周期5蛋白的生产，同时保持柔韧性，以定位和由此所选择的蛋白， 即纤维素酶的翻译后修饰。这使得生产的纤维素酶（S）的基本分析，同时也奠定了在植物中进一步表达策略。使用这样的瞬时表达的策略，从糖基水解酶家族5，Cel5A，从真菌宿主里氏木霉 （ 红褐肉座菌 ）衍生的6内切葡聚糖酶的产生（以下简称为TrCel5A）。 TrCel5A是一个42 kDa蛋白被糖化本身，是路政署高度活跃roylzing纤维素链7。
这里所描述的瞬时表达技术是基于一个较为常用的系统上，渗入植物叶与土壤杆菌携带目的基因在适当的表达载体中。以允许成功的在植物中表达的快速分析，TrCel5A也可以被表达为融合蛋白的mCherry，最初来源于Discosoma藻单体荧光蛋白。蛋白DsRed的8，具有一个额外的6组氨酸残基（His-标签）融合到在C-末端（TrCel5A-的mCherry）。异源融合蛋白，TrCel5A-的mCherry，表达因此可以生长的植物中通过使用绿色光检查的mCherry分散监控。如果需要，该植物材料的薄的部分可以根据绿色光被显微镜检查，以确定该蛋白的特异性定位。对于这项工作，信号和转录坐在肽在结构注册成立，本地化的异源蛋白出口到内质网9。
以分析植物中表达的纤维素酶，包括TrCel5A，一些纤维素酶活性测试可以被执行的活动。总可溶性植物蛋白的提取后，TrCel5A可以部分地用热温育技术纯化。蛋白质大小是使用SDS-PAGE随后通过Western印迹法确定。酶谱法可用于分析活性对底物， 例如纤维素这一直是羧基甲基化（使羧甲基纤维素：CMC）为溶解度10。纤维素酶和葡糖苷酶的活性可以通过用β-D-纤维二糖苷相关的荧光团4 – 甲基伞形酮（4-MU）（4-MUC组合）进行监测。评估切葡聚糖酶活性的另一种方法涉及到CMC的光谱测定分析已用的偶氮-D相关联的你们（Remazolbrilliant蓝R）11。此外，这两种内切葡聚糖酶和纤维素酶的范围中的蛋白质的活性可以通过使用糖分析测试，如对羟基苯甲酸酰肼（PAHBAH）测定12进行监测。这些技术可用于澄清和量化感兴趣的表达纤维素酶的活性。
Protocol
Representative Results
Discussion
纤维素酶的重组表达是非常关注的一个领域，因为更有效的生物燃料生产系统1的愿望。植物提供了许多可能性，成功的纤维素酶生产，具有的功能，如经济采伐技术和自动水解方法是非常理想的特性进行大规模的生物燃料生产。另外，使用不同的本地化的用于生产蛋白质允许（如果需要），翻译后修饰20。改变的植物，以使纤维素酶的组成型表达，同时提供明显的好处，是其可能…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作是支持的BMBF Forschungsinitiative“BioEnergie 2021 – Forschung献给死去Nutzung冯Biomasse”创优“量身定制燃料生物质”，它是通过卓越计画经费由德国联邦和州政府，以促进科学的集群并在德国大学的研究。
Materials
| 4-methylumbelliferyl β-D-cellobioside | SIGMA-ALDRICH | M6018 | |
| Acetic acid | ROTH | 3738 | |
| Acetosyringon (concentrated) | ROTH | 6003 | |
| Antibiotic – kanamycin | ROTH | T832 | |
| Antibiotic – rifampicin | ROTH | 4163 | |
| Antibiotic – carbenicillin | ROTH | 6344 | |
| Antibody – rabbit anti His(6) pAb | ROCKLAND | 600-401-382 | |
| Antibody – goat anti rabbit AP, FC pAb | DIANOVA | 111-055-008 | |
| Azo-carboxymethyl cellulose | MEGAZYME | S-ACMC | |
| β-cyclodextrin | SIGMA-ALDRICH | C4805 | |
| Calcium chloride dihydrate | SIGMA-ALDRICH | C5080 | |
| Carboxymethyl cellulose | ROTH | 3333.1 | |
| Cellulase from Trichoderma reesei ATCC 26921 | SIGMA-ALDRICH | C2730 | |
| Congo red | SIGMA-ALDRICH | 75768 | |
| Coomasie brilliant blue G 250 | ROTH | 9598.2 | |
| D(+)-glucose | ROTH | 8337 | |
| Ethanol | ROTH | K928 | |
| Filter paper – Rotilabo blotting paper | ROTH | CL67 | |
| NBT/BCIP | SIGMA-ALDRICH | 72091 | |
| MES buffer | ROTH | 4256 | |
| Methanol | ROTH | 8388 | |
| Sodium citrate | ROTH | 3580 | |
| Sodium dodecylsulfate | SERVA | 20765 | |
| Sodium hydroxide | ROTH | 6771 | |
| Soil, Einheitserde classic | PATZER GMBH | ||
| Spectrometer – Infinite M200 | TECAN | ||
| Sucrose | SIGMA-ALDRICH | S-5390 | |
| 4-Hydroxy benzhydrazide | SIGMA-ALDRICH | H9882 | |
| Phosphate buffered saline | ROTH | 1058 | |
| UV light source – BLAK RAY | UVP | ||
| Vibratome – VT1000S | Leica |
References
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