Trypanosomes में आरएनए संपादन के खिलाफ दवाओं स्क्रीनिंग के लिए एक पत्रकार के रूप में शाही सेना उत्प्रेरक
Summary
A highly sensitive ribozyme-based assay, applicable to high-throughput screening of chemicals targeting the unique process of RNA editing in trypanosomatid pathogens, is described in this paper. Inhibitors can be used as tools for hypothesis-driven analysis of the RNA editing process and ultimately as therapeutics.
Abstract
काफी प्रगति trypanosomes में mitochondrial आरएनए संपादन के तंत्र का पता लगाने में किया गया है. इसी तरह, काफी प्रगति आरएनए संपादन उत्प्रेरित कि editosome परिसर के घटकों की पहचान करने में किया गया है. हालांकि, यह उन प्रोटीन एक साथ कैसे काम अभी भी स्पष्ट नहीं है. Editosome के खिलाफ एक उच्च throughput स्क्रीन से प्राप्त रासायनिक यौगिकों संपादन चक्र में एक या एक से अधिक चरणों ब्लॉक या प्रभावित कर सकता है. इसलिए, नए रासायनिक यौगिकों की पहचान editosome समारोह और विधानसभा विदारक के लिए बहुमूल्य आणविक जांच उत्पन्न करेंगे. पिछले अध्ययनों में, इन विट्रो संपादन assays रेडियो लेबल शाही सेना का उपयोग किया गया. ये assays समय अक्षम और उच्च throughput उद्देश्यों के लिए अनुपयुक्त, उपभोग कर रहे हैं. इधर, एक समरूप प्रतिदीप्ति आधारित "मिश्रण और उपाय" शाही सेना संपादन की निगरानी के लिए हथौड़ा ribozyme इन विट्रो संवाददाता परख, प्रस्तुत किया है. केवल की शाही सेना संपादन का एक परिणाम के रूप मेंहथौड़ा ribozyme एक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) oligoribonucleotide सब्सट्रेट दरार आए. इससे एक संकेत के उत्पादन पीने की वस्तु से फ्लोरोफोरे की जुदाई में यह परिणाम है. Editosome समारोह हिचकते है जब इसके विपरीत, प्रतिदीप्ति संकेत बुझती किया जाएगा. इस विट्रो आरएनए संपादन या editosome समारोह को बाधित कर सकते हैं कि रसायनों के उच्च throughput स्क्रीनिंग में नजर रखने के लिए आम तौर पर लागू किया जाना चाहिए कि एक बेहद संवेदनशील और सरल परख है.
Introduction
शाही सेना संपादन, एक के बाद transcriptional mRNA संशोधन की प्रक्रिया, पहली trypanosomatids 1 में खोज की थी. तब से पर्याप्त काम ट्रिपैनोसोमा ब्रुसे 2,3 में शाही सेना संपादन के पीछे तंत्र का अध्ययन करने में आयोजित किया गया है. एंजाइमी प्रतिक्रियाओं की एक श्रृंखला में, editosome, के बारे में 20 प्रोटीन का एक कोर परिसर, ऊर्जा पैदा oxidative phosphorylation प्रणाली के कई घटकों के लिए परिपक्व mitochondrial mRNAs बनाता है. उत्प्रेरक की घटनाओं का क्रम गाइड RNAs (gRNAs) द्वारा निर्धारित रूप में, endonucleolytic दरार, uridylate (यू) के अलावा या हटाने, और बंधाव है 4.
कोर editosome जटिल प्रोटीन के अलावा, सहायक कारकों की एक संख्या भी 5-7 पहचान की गई है. ये प्रोटीन ज्यादातर स्वतंत्र परिसरों में वर्गीकृत किया है देखा जाता है. हालांकि, कोर editosome परिसर में प्रोटीन विधानसभा के आदेश और सहायक के साथ कोर परिसर से बातचीत पैटर्नपरिसरों अभी तक निर्धारित किया है. Trypanosomatids में शाही सेना के संपादन की प्रक्रिया का लक्ष्य निर्धारण रासायनिक dissectors प्रदान कर सकता है कि editosome परिसर के विधानसभा और समारोह का अध्ययन करने में सहायता. इसके अलावा, कई editosome प्रोटीन पर कार्यात्मक अध्ययन दवा 8-12 लक्ष्य के रूप में अपनी क्षमता का संकेत है, विभिन्न चरणों जीवन भर अनिवार्यता से पता चला है. इसलिए, editosome का पाया inhibitors भी trypanosomatids के खिलाफ नेतृत्व यौगिकों के रूप में कार्य कर सकते हैं. Trypanosomatid के कारण बीमारियों के खिलाफ वर्तमान में उपलब्ध दवाओं, विषाक्त अक्षम और 13,14 महंगे हैं, क्योंकि यह समय पर है.
एक कुशल और सुविधाजनक इन विट्रो परख शाही सेना संपादन ब्लॉक कि विशिष्ट inhibitors के लिए रासायनिक ब्रह्मांड का अन्वेषण करने के लिए आवश्यक है. तीन assays विकसित और editosome गतिविधियों पर नजर रखने के लिए इस्तेमाल किया गया है: इन विट्रो आरएनए संपादन परख 15 (क) में पूरा दौर, (ख) इन विट्रो आरएनए संपादन परख 16,17, में पूर्व cleaved एकND (ग) हथौड़ा ribozyme (HHR) परख 18 के आधार पर. पहले दो assays रेडियोधर्मिता की मदद से संपादित उत्पाद (ATPase 6 mRNA) के प्रत्यक्ष दृश्य पर भरोसा करते हैं. HHR आधारित परख संपादन पर एक ribozyme के रूप में व्यवहार करने के लिए मॉडलिंग की है कि ATPase 6 mRNA का एक संशोधित संस्करण का उपयोग करता है. कार्यात्मक ribozyme तो विशेष रूप से एक पत्रकार के रूप में सेवारत एक radiolabeled शाही सेना सब्सट्रेट cleaves. हाल ही में, Moshiri एट अल. विकसित एक 'मिश्रण और उपाय' radiolabeled शाही सेना सब्सट्रेट एक प्रतिदीप्ति प्रतिध्वनि ऊर्जा हस्तांतरण (झल्लाहट) सब्सट्रेट 19 से बदला गया है जहां शाही सेना संपादन की निगरानी के लिए इन विट्रो संवाददाता परख में HHR आधारित. इस परख के सिद्धांत फायदे हैं: (क) यह सक्रिय ribozyme और सब्सट्रेट दरार का उत्पादन कम मात्रा (यानी 20 μl) में एक ही ट्यूब में एक साथ होते हैं, के रूप में एक तेजी से और सुविधाजनक मिश्रण और परख के उपाय प्रकार है, (ख ) यह radioactively लेबल सामग्री के प्रयोग से बचा जाता है, (ग) संवेदनशीलता कि एक हैप्रतिदीप्ति एक माइक्रो अनुमापांक थाली प्रारूप में इंस्ट्रूमेंटेशन, और (घ) शोर अनुपात करने के लिए एक उच्च संकेत द्वारा fforded. इस परख का प्रयोग, शुद्ध editosome के खिलाफ ज्ञात आरएनए संपादन ligase inhibitors का प्रभाव 19 की पुष्टि की थी. इस प्रयोग मुख्य रूप से टी. से पूरे editosomes के खिलाफ, शाही सेना संपादन inhibitors की तेजी से पहचान के लिए परख मान्य ब्रुसे.
संख्या 1 के एक विस्तृत कदम दर कदम योजनाबद्ध है प्रतिदीप्ति आधारित इन विट्रो आरएनए संपादन परख में. इस प्रोटोकॉल या तो इन विट्रो में शाही सेना के संपादन की निगरानी या आसानी से विभिन्न तराजू के यौगिक पुस्तकालयों स्क्रीनिंग के लिए अनुकूलित किया जा के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है.
Protocol
Representative Results
Discussion
Trypanosomes की शाही सेना संपादन जटिल खिलाफ inhibitors की पहचान के लिए एक उपन्यास उच्च throughput स्क्रीनिंग विधि trypanosomatids के कारण बीमारियों का मुकाबला करने के लिए दवाओं की खोज के लिए एक नया उपकरण उपलब्ध कराने, प्रस्तुत किया ग…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Najmeh Nikpour and Fiona Alum provided suggestions and edited this manuscript. Department of Biochemistry at McGill University supported HM and VM with the CIHR Training Initiative in Chemical Biology. This work was supported by Canadian Institute of Health Research (CIHR) grant 119464 (to R. S.).
Materials
| Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
| SDM-79 Medium | Gibco by life technologies | ||
| Fetal Bovine Serum | life technologies | 12483-020 | heat inactivation at 550C for 1 h |
| Hemin, minimum 80% | Sigma | H5533-10G | |
| Penicillin-Streptomycin Sollution | Fisher Scientific | MT-30-002-CI | |
| Dnase 1 recombinant, Rnase Free | Roche | 4716728001 | |
| T7 RiboMax Express Large scale RNA production system | Promega | P1320 | |
| Kimble Kontes Dounce Tissue Grinders | Fisher Scientific | K885300-0040 | |
| Gradient Master, ver 5.25 | Biocomp | 107-201M | |
| Ultra Clear Tube, 13.2ML | Beckman Coulter | 344059 | |
| Optima L-100XP Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 392052 | |
| SW 41 Ti ROTOR | Beckman Coulter | 331336 | |
| MicroSeal 'B' Seal, Seals | Biorad | MSB1001 | |
| CFX 384 Touch Real-Time PCR Detection System | Biorad | 185-5484 | |
| Acryl/Bis solution (19: 1), 40% (w/v) | Bio Basic | A0006-500ML | |
| Urea, Molecular biology grade, 1Kg | life technologies | AM9902 |
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