An approach is presented for determining structures of viral membrane glycoprotein complexes using a combination of electron cryo-tomography and sub-tomogram averaging with the computational package Jsubtomo.
Höljeförsedda virus utnyttjar membranglykoproteiner på sin yta för att mediera inträde i värdceller. Tredimensionell strukturanalys av dessa glykoprotein "spikes" är ofta tekniskt utmanande men viktigt för att förstå viral patogenes och läkemedelsdesign. Här är ett protokoll presenteras för viral spik strukturbestämning genom beräkningsmedelvärdes av elektron Cryo-tomografi uppgifter. Elektron Cryo-tomografi är en teknik i elektronmikroskop används för att härleda tredimensionella tomografiska volym rekonstruktioner eller tomogram, av pleomorfa biologiska prover såsom membran virus i en nästan infödda, frysta hydrerad tillstånd. Dessa tomogram avslöjar strukturer av intresse i tre dimensioner, om än i låg upplösning. Beräkningsmedelvärdesunder volymerna eller under tomogram, krävs för att uppnå högre upplösning detalj av upprepande strukturella motiv, såsom virala glykoprotein spikar. En detaljerad beräkningsmetoden för aligning och genomsnitt under tomogram använder Jsubtomo programpaket skisseras. Detta tillvägagångssätt möjliggör visualisering av strukturen av virala glykoprotein spikar till en resolution i intervallet 20-40 Å och studier av studiet av högre ordning spike-to-spik interaktioner på virionens membranet. Typiska resultat presenteras för Bunyamwera virus, ett höljevirus från familjen Bunyaviridae. Denna familj är en strukturellt skiftande grupp av patogener som utgör ett hot mot människors och djurs hälsa.
Elektron Cryo-tomografi är en elektron Cryo-mikroskopi bildteknik som gör det möjligt att beräkna ett tredimensionellt (3D) rekonstruktion av komplexa biologiska prover. Lämpliga prover varierar från renade makromolekylära komplex 1, filament 2, belagda vesiklar 3 och pleomorfa membranvirus fyra till hela prokaryota celler 5 och till och med tunna områden i hela eukaryota celler 6. Efter insamling av en lutning-serien, 3D tomografiska volymer eller tomogram uppgifter, kan beräknas med hjälp av flera etablerade programvarupaket, inklusive Bsoft 7 och IMOD 8.
Två aspekter inneboende för studier av biologiska prover genom elektron Cryo-tomografi gränsen den biologiska tolkningen av motsvarande tomografiska volymer. Först, på grund av den begränsade elektron dos som kan tillämpas på biologiska material innan man inför betydande skada strålning, signal-till-brus-förhållanden i tomografiska data som är typiskt mycket låg. För det andra, på grund av begränsat urval lutningsgeometrin under datainsamling, vissa vyer av objektet förblir frånvarande, vilket leder till ett så kallat "saknade wedge" artefakt i tomografisk volymen. Däremot kan båda dessa begränsningar övervinnas om tomografiska volymen innehåller upprepande identiska strukturer, såsom makromolekylära komplex, som kan vara framgångsrikt i genomsnitt 9-12.
Före medelvärdes strukturer från tomogram rekonstruktioner, måste objekt av intresse hittas och anpassas till samma orientering. Lokalisera sådana strukturer kan uppnås genom korskorrelation av en mallstruktur i det tomografiska volym med användning av ett tillvägagångssätt som ofta hänvisas till som mall matchning 13. Den mall som används i denna matchningsprocess kan härledas från elektron Cryo-mikroskopi eller elektron Cryo-tomografi kombination med 3D-rekonstruktion, eller det kan vara en täthet karta simuleras frånett atomstruktur. Flera beräknings paket har utvecklats för att utföra dessa uppgifter 11.
Medelvärde av glykoprotein spikar av membran virus, såsom HIV-1, har varit en särskilt framgångsrik metod för att studera deras struktur 14-16. En förståelse av strukturen är i ett stycke för att avslöja både den molekylära grunden för virus-värdinteraktioner och leds antivirala och vaccin design utveckling. Även makromolekylära kristallografi är den teknik val för hög upplösning (oftast bättre än 4 Å) strukturell analys av enskilda virala glykoproteiner och deras komplex, röntgenstrukturer som följer av denna metod är av proteiner isolerade från den naturliga membranmiljön på virionens . Sålunda viktiga detaljer såsom den högre ordning arkitektur av virala glykoproteiner, inom ramen för virionen, förbli saknas. Å andra sidan, elektron kryo-mikroskopi och enda partikel återuppbyggnadav hela virus med hölje är begränsad till virioner med ikosahedra symmetri 17,18. Elektron cryotomography kombination med undervolym anpassning har alltså vuxit fram som en kompletterande teknik som gör det möjligt att studera glykoprotein spikar av oregelbundet formade, pleomorfa virus i situ.
Vi har utvecklat programvara som heter Jsubtomo (www.opic.ox.ac.uk/jsubtomo) för påvisande, justering och medelvärdesbildning av tomografiska under volymer. Jsubtomo har utnyttjats i strukturen bestämningen av ett antal cellulära och virala strukturerna 19-26. Här redogör vi för ett detaljerat protokoll som gör det möjligt för bestämning viral-yta spik strukturer. För att kringgå över förfining av medelvärdes strukturer genom att korrelera buller, är den "guldstandard" förfining som antogs 10,27. Slutligen strategier för visualisering och tolkning av typiska resultat diskuteras.
Kunskap om viral glykoprotein spik struktur på virionens membranet är nödvändig för att förstå virusreplikation och utveckla läkemedel för att behandla och förebygga infektioner. Elektron Cryo-mikroskopi kombinerat med enda partikel medelvärdes har blivit den mest använda metoden för att lösa strukturer omhöljda viruspartiklar, inklusive glykoprotein spikar. Dock är denna metod begränsad till icosahedrally symmetriska virus. Här, genom tillämpning av elektron Cryo-tomografi och subtomogram medelvärdes i Jsubtomo, har vi sammanställt ett allmänt protokoll för bestämning glykoprotein spikar på pleomorfa virus med hölje som inte är mottagliga för andra aktuella strukturbiologiska metoder. Våra representativa resultat visar att utgången av denna metod är tillräcklig för att avslöja insikter domänarkitektur, oligomerisering och högre ordningens organisation glykoprotein spikar på intakta virioner.
jove_content "> Det mest kritiska steget i detta protokoll är att konstruera två modeller tillförlitliga utgångs som statistiskt oberoende av varandra. Framgångsrikt genomförande av detta steg förutsätter att glykoprotein spikar är tillräckligt stora och inte packas mot varandra för hårt, så att enskilda spikar kan visuellt erkännas och manuellt plockas i tomogram, och två oberoende modeller genomsnitt. Om detta inte är möjligt, två ändringar i protokollet kan försök. Först två oberoende slumpmodeller kan konstrueras genom att först definiera två slump delmängder av subtomograms och sedan medelvärdes subtomograms inom dessa undergrupper 30. det andra, om en struktur av den isolerade spik har härletts med andra medel, till exempel genom röntgenkristallografi, kan den användas som en startmodell. Emellertid måste försiktighet iakttas för att låg- lågpassfilter denna modell med en lågupplöst cut-off (50-70 Å), eftersom de två resulterande modellerna i nästa omgång av förfining kommervara statistiskt oberoende endast bortom denna resolution. På grund av detta förbehåll är det tidigare tillvägagångssätt rekommenderas.Den kan erhållas upplösning från detta protokoll beror på fyra viktiga faktorer: i. datainsamling strategi och kvaliteten på indata, ii. antal av de subtomograms, iii. inriktnings noggrannhet subtomograms, och iv. heterogenitet av strukturerna. Medan den första och andra begränsningar kan till stor del övervinnas genom användning av höga signal-till-brus direkt elektrondetektorer i kombination med CTF korrigerade tomografi och insamling automatiserade uppgifter, är inriktnings noggrannheten ytterligare påverkas av storleken och formen på strukturen av intresse i sig. Vid tillämpning av detta protokoll om små spikar som saknar framträdande, kan det vara fördelaktigt att binda Fab-fragment i spetsen för att förbättra anpassningen noggrannhet och därmed upplösning 31. Slutligen, om de strukturer som medelvärdet uppvisar flera konformationer, under tomogram klassificeringsmetoder får användas för att i genomsnitt olika konformationer för sig. För detta ändamål Jsubtomo integrerar med Dynamo paket, som erbjuder effektiv subtomogram klassificering 9.
Det ovanstående protokollet är komplementär till röntgenkristallografi av isolerade virala glykoproteiner. Kristallografiska strukturer kan passas in medelvärden under tomogram för att erhålla den exakta orienteringen av glykoproteinet med avseende på virionet membranet. Tillämpningen av denna metod kommer utan tvekan att fortsätta att kasta ljus på insvept virus struktur och patobiologi.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the Academy of Finland (130750 and 218080 to J.T.H.), the Wellcome Trust (090532/Z/09/Z; 089026/Z/09/Z to T.A.B.), and by the MRC (MR/J007897/1 to J.T.H and T.A.B; MR/L009528/1 to T.A.B.).
Name of Material/ Equipment | Company | Catalog Number | Comments/Description |
Jsubtomo (ver 1.3.1) | University of Oxford | n/a | www.opic.ac.uk/jsubtomo |
Bsoft (ver 1.8.7) | NIAMS, NIH | n/a | bsoft.ws |
UCSF Chimera | UCSF | n/a | www.cgl.ucsf.edu/chimera |